探讨主动外排机制在临床分离鲍曼不动杆菌对替加环素耐药性中的作用。
微量肉汤稀释法检测临床分离鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药性，测定经外排泵抑制剂处理前后鲍曼不动杆菌对替加环素最小抑菌浓度(MIC)的变化，以聚合酶链反应(PCR)、实时荧光定量逆转录(Real–time RT)–PCR检测主动外排基因adeB、adeJ、abeM携带及其表达水平，以及外排泵AdeABC双组份调节系统基因adeR和adeS。
67株临床分离鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药率为22.39%(15/67)，并存在药物的主动外排。所有菌株adeB基因的检出率为88.06%(59/67)，adeJ、abeM基因的检出率为100%(67/67)。耐药株adeB和adeJ基因的表达量较敏感株分别增加了17.88倍与6.07倍，而abeM基因的表达量无明显增加。耐药株与敏感株相比，adeR和adeS基因仅发现个别位点有点突变。
外排泵系统AdeABC和AdeIJK可能在中国西部鲍曼不动杆菌流行株对替加环素的耐药中发挥一定的作用，但adeB基因转录的上调与调控基因adeR、adeS突变无关。外排泵系统AbeM可能与鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药无关。
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鲍曼不动杆菌(A.baumannii)是院内感染的重要条件致病菌。随着临床抗菌药物的大量使用，不动杆菌出现了多重耐药、泛耐药甚至全耐药株，给临床感染的控制带来严峻的挑战。Ozdem等[1]研究表明2007至2010年不动杆菌的耐药率逐年上升，2010年分离的不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率高达80%。替加环素是新一代四环素类衍生物，研究表明其对多重耐药或泛耐药不动杆菌感染有较好疗效[2]，成为控制临床多重耐药或泛耐药不动杆菌感染的"最后选择"，但也有研究发现不动杆菌对替加环素也存在耐药性，其耐药机制可能与外排泵系统主动外排有关[3,4]。
本研究以67株鲍曼不动杆菌临床分离株为对象，采用微生物学方法筛选出对替加环素耐药株，研究外排泵抑制剂的干预作用，并应用分子生物学方法检测RND型外排泵AdeABC、AdeIJK泵基因和MATE型外排泵AbeM泵基因携带、表达及外排泵AdeABC的双组分调控系统AdeRS的基因序列变化情况，初步探讨主动外排系统在鲍曼不动杆菌对替加环素耐药性中的作用。
收集四川地区13家医院2011年临床分离的不动杆菌属细菌共82株，初步物种鉴定采用法国bioMerieux VITEK Ⅱ全自动细菌鉴定仪鉴定为不动杆菌，所有菌株均使用聚合酶链式反应(PCR)进行不动杆菌管家基因recA及gyrB检测并部分测序鉴定，其中67株为鲍曼不动杆菌[5]。大肠埃希菌(ATCC 25922)为质控菌株，来源于四川大学华西医院感染性疾病中心抗感染药物研究室。药敏质控结果符合美国临床实验室标准化委员会(CLSI)药敏质控要求[6]。
PCR扩增仪(美国BIO–RAD公司，S1000型)、荧光定量PCR仪(美国BIO–RAD公司，CFX96型)；电泳仪(美国BIO–RAD公司)；凝胶成像系统(美国BIO–RAD公司，GELDOC 1000型)；细菌比浊仪(法国梅里埃公司)；低温冷冻离心机(美国Thermo公司)等。MH琼脂购自青岛海博公司；MH Ⅱ肉汤购自美国BD公司；泵抑制剂羰基氰化氯苯腙(CCCP)购自美国Sigma公司，替加环素临床品购自惠氏公司。总RNA提取试剂盒、反转录及去除基因组DNA试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)、SsoFast Eva Green荧光定量PCR试剂盒购自美国BIO–RAD公司；用于荧光定量PCR的带滤芯枪头为美国AXYGEN产品。引物参阅文献[7,8,9,10,11]或使用primr 3自行设计，由北京华大基因公司合成。
采用微量肉汤稀释法测定鲍曼不动杆菌对替加环素的MIC，严格按照美国CLSI的操作方法进行[6]，每个菌株做3个复孔。由于美国CLSI、美国食品药品监督管理局(FDA)、英国抗微生物化疗学会(BSAC)及欧洲抗生素药物敏感试验委员会(EUCAST)等均无替加环素对不动杆菌MIC值的判读标准，本研究参照文献[12]采用FDA中肠杆菌科细菌对替加环素体外敏感性判读标准执行，根据所测得的MIC值判读为敏感≤2 mg/L，中介＝4 mg/L，耐药≥8 mg/L。
将所有替加环素耐药株及2株替加环素敏感株分别加入同时含10 μg/ml CCCP和不同浓度替加环素的微量板，测定替加环素对耐替加环素不动杆菌的MIC值，比较CCCP应用前后同一菌株对替加环素MIC值的变化。应用CCCP后，其MIC值较使用前呈4倍以上下降，判定为外排泵阳性菌株。
提取并纯化细菌基因组DNA作为扩增模板，检测外排泵基因adeB、adeJ、abeM及外排泵AdeABC的双组分调控系统基因adeR、adeS，所用的引物详见表1。产物经含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下成像分析结果。
鲍曼不动杆菌外排泵基因和外排泵AdeABC调控基因及实时荧光定量逆转录PCR引物
鲍曼不动杆菌外排泵基因和外排泵AdeABC调控基因及实时荧光定量逆转录PCR引物
| 基因 | 引物序列(5'→3') | 退火温度(℃) | 参考文献 |
|---|---|---|---|
| adeB | F: GTATGAATTGATGCTGC | 60 | [10] |
| R: GTATGAATTGATGCTGC | |||
| adeJ | F: GATTCAGCGTGGTATGGC | 55 | [11] |
| R: ACGTTCGAGACGTGGAGA | |||
| abeM | F: GTAGGTGTAGGCTTATGGA | 55 | [12] |
| R: GTACCGAAGTGACTGAAAT | |||
| adeR | F: ATGTTTGATCATTCTTTTTCTTTTG | 46 | [13] |
| R: TTAATTAACATTTGAAATATG | |||
| adeS | F: ATGAAAAGTAAGTTAGGAATTAGTAAG | 50 | [5] |
| R: TTAGTTATTCATAGAAATTTTTATG | |||
| adeB (定量) | F: AACGGACGACCATCTTTGAGTATT | 60 | [5] |
| R: CAGTTGTTCCATTTCACGCATT | |||
| adeJ (定量) | F: ATGAGAAACTGATTGCAGCTC | 60 | 本研究 |
| R: TGAGGAGTATCTTCCTGACCA | |||
| abeM (定量) | F: AGGCTTCGGCTTATCGAAAC | 60 | 本研究 |
| R: AGAGGGCTAAGGACCAATGC | |||
| 16sRNA(定量) | F: CAGCTCGTGTCGTGAGATGT | 60 | [14] |
| R: CGTAAGGGCCATGATGACTT |
注：F为上游引物，R为下游引物
细菌总RNA提取严格按照说明书操作。提取的RNA去除基因组DNA后逆转录合成cDNA，去除基因组DNA反应体系及条件：5×gDNA Eraser buffer 2 μl，gDNA Eraser 1 μl，细菌总RNA 1 μl，RNase free dH2O 6 μl，42 ℃ 2 min，4 ℃；逆转录反应体系及条件：5×primerScript buffer 4 μl，primerScript RT Enzyme Mix 1 μl，RT primer Mix 1 μl，去除基因组DNA反应液10 μl，RNase free dH2O 4 μl，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。
67株鲍曼不动杆菌对替加环素的MIC范围为0.25～16 μg/ml，MIC50为4 μg/ml，MIC90为8 μg/ml，共筛选出替加环素耐药株15株，耐药率为22.39%(15/67)。
在含10 μg/ml CCCP的MHⅡ肉汤中，所有菌株生长良好，表明10 μg/ml CCCP对细菌无抑制作用。对耐药株进行CCCP处理后，替加环素对15株替加环素耐药株中的7株的MIC值呈4倍以上下降，判定为外排泵阳性菌株。外排泵抑制剂CCCP处理前后鲍曼不动杆菌对替加环素MIC值变化情况详见表2。
外排泵抑制剂CCCP处理前后鲍曼不动杆菌对替加环素MIC值变化情况
外排泵抑制剂CCCP处理前后鲍曼不动杆菌对替加环素MIC值变化情况
| 菌株编号 | 最低抑菌浓度(μg/ml) | |
|---|---|---|
| TGC | TGC＋CCCP | |
| 1 | 8 | 2.00 |
| 2 | 8 | 4.00 |
| 3 | 8 | <0.03a |
| 4 | 16 | 0.06a |
| 5 | 8 | 0.06a |
| 6 | 8 | 2.00 |
| 7 | 8 | <0.03a |
| 8 | 8 | 2.00 |
| 9 | 8 | 0.06a |
| 10 | 8 | 2.00 |
| 11 | 8 | 4.00 |
| 12 | 8 | <0.03a |
| 13 | 8 | 2.00 |
| 14 | 8 | 4.00 |
| 15 | 8 | <0.03a |
注：TGC：替加环素；CCCP：羰基氰氯苯腙；a外排泵阳性菌株
67株鲍曼不动杆菌中，adeB基因检出率为88.06%(59/67)，adeJ、abeM基因的检出率为100%，所有替加环素耐药菌株均可检出adeB基因条带，即adeB、adeJ、abeM基因均阳性的替加环素耐药株共15株、敏感株共44株。adeB、adeJ、abeM基因部分PCR结果见图1，图2，其扩增阳性PCR产物部分经测序比对证实。
PCR扩增临床分离菌株adeR基因及adeS基因片段，15株耐药菌株均可见685 bp(adeR基因)及1 073 bp(adeS基因)的扩增片段，部分adeS基因PCR结果见图3。对临床分离菌株adeR和adeS基因PCR扩增产物进行正负双向测序，耐药株与敏感株相比，仅发现个别位点有点突变，未发现耐药株较敏感株同时存在某一位点的突变。相应突变点所在序列推导的氨基酸序列较敏感株相应序列比对均未出现氨基酸替代。测得序列结果进行比对，与GenBank上公布的鲍曼不动杆菌ATCC 17978 adeR和adeS基因序列同源性为97%～98%。
应用real time RT–PCR法检测15株替加环素耐药菌及10株敏感株(adeB、adeJ、abeM基因均阳性)外排泵基因表达情况(每个样本3个复孔)。目的基因与内参基因的扩增动力学曲线呈S型光滑扩增曲线，指数增长期明显；其融解曲线只有单峰值，反应具有很好的特异性。反应结束即可得到各个待测标本的基因循环阈值CT值。耐药株及敏感株adeB、adeJ、abeM基因表达量差异采用比较CT值法(2–ΔΔCT法)，计算公式：①改变的倍数＝2–ΔΔCT，②ΔCT＝(CT靶基因–CT内参)，ΔΔCT＝ΔCT耐药株组–ΔCT敏感株组。结果显示(图4)，替加环素耐药菌株adeB基因和adeJ基因的表达量平均较敏感菌株分别增加了17.88倍与6.07倍，而abeM基因的表达量无明显增加(1.11倍)。
将药物主动外排至细菌细胞外是鲍曼不动杆菌对替加环素的主要耐药机制，外排泵在能量支持下可将进入细胞的药物选择性或非选择性地排出，当细菌体内某种调节机制发生改变，导致外排系统表达增强，使细菌细胞内的药物浓度降低而出现耐药。根据外排系统蛋白氨基酸同源性可分成5个家族：主要易化子超家族(MFS)、小多重耐药性家族(SMR)、耐药结节分化超家族(RND)、多药及毒性化合物外排家族(MATE)、ATP结合盒超家族(ABC)。与鲍曼不动杆菌耐药相关的外排系统主要有RND家族中的AdeABC、AdeIJK和MATE家族中的AbeM外排系统。外排泵抑制剂CCCP是质子泵抑制剂，是一种能在磷脂膜两侧自由扩散，传递质子以破坏跨膜电化学梯度的强解偶联剂，导致转运蛋白失去能量供应，破坏外排系统的主动外排作用，使药物在细菌体内的累积量增加，恢复细菌对药物的敏感性。
本研究中67株鲍曼不动杆菌中替加环素耐药株检出率为22.39%，与Liu等[12,13]报道相似。15株替加环素耐药株加入替加环素与CCCP后，替加环素对其中7株的MIC值呈4倍以上下降。说明外排泵在鲍曼不动杆菌对替加环素耐药中起一定作用，但是仍有部分菌株在加入外排泵抑制剂后其MIC无明显下降，说明泵抑制剂CCCP能部分逆转外排泵导致的耐药或者可能还存在其他耐药机制[14]。
67株鲍曼不动杆菌中adeB基因的携带率为88.06%(59/67)，而adeJ和abeM基因的携带率为100%，说明外排泵基因在鲍曼不动杆菌中普遍存在。本研究还发现临床分离耐药菌株组adeB、adeJ的表达量高于敏感菌株组，且外排泵AdeIJK表达量低于adeABC的表达，而abeM的表达量无明显差异，表明外排泵AdeABC和AdeIJK的过度表达可能在我国四川地区临床分离鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药中发挥一定作用。外排泵AbeM可能与鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药无关。国外Coyne等[15]和Marchand等[16]研究也表明外排泵系统AdeABC和AdeIJK为鲍曼不动杆菌对替加环素主要的耐药机制，且AdeIJK表达量低于AdeABC的表达[15]。另外，本研究所使用的鲍曼不动杆菌临床株均在替加环素在中国上市前收集，但仍能检测出耐药株，也可能与替加环素的耐药机制主要为外排泵基因过度表达有关。外排泵从底物特异性上看分为特异性外排泵和多重耐药外排泵，多重耐药外排泵底物谱广，可以排出大量结构迥异的抗菌药物及其他有毒物质。可能鲍曼不动杆菌AdeABC、AdeIJK外排泵为多重耐药外排泵，随着国内抗菌药物的大量使用，菌株外排泵被活化，可以非选择性地排出包括替加环素在内的多种作用底物。在临床工作中，感染具有相似耐药机制病原微生物(如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)、且有抗菌药物使用史的病人，应警惕可能发生替加环素耐药的概率会升高，使用替加环素治疗时应注意反复培养病原菌并进行药敏试验，及时调整用药。
调节基因adeR和adeS基因在adeA基因的上游，与adeABC基因呈反向表达，编码反应调节蛋白AdeR和感应激酶AdeS。感应激酶AdeS可以感应外环境条件的变化，并相应地调节AdeR的活性状态，激活或钝化调节蛋白AdeR，再由AdeR控制外排泵基因adeABC的表达[15,16]。本研究通过对临床分离鲍曼不动杆菌扩增调控基因adeR、adeS并测序比对结果表明adeB基因转录的上调与调控基因adeRS突变无关。Sun等[17]也发现替加环素耐药鲍曼不动杆菌adeB转录增加与adeRS突变无关，与本实验研究结果类似。但国外Marchand等[16]研究发现AdeABC外排泵系统中的adeR点突变(Pro116→Leu)和adeS点突变(Thr153→Met)也能引起外排泵的过度表达，与本实验研究结果不同，考虑与所选的菌株不同有关，同时也考虑adeB转录的上调除和调控基因突变有关外，可能还存在其他机制，值得进一步探讨。
总之，外排泵基因adeB、adeJ和abeM在鲍曼不动杆菌临床分离株中普遍存在，外排泵系统AbeM可能与鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药无关，外排泵系统AdeABC和AdeIJK可能在中国西部鲍曼不动杆菌流行株对替加环素的耐药中发挥一定的作用，但可能还存在其他的耐药机制。本研究所选菌株adeB转录的上调与调控基因adeRS突变无关，可能还存在其他导致adeB转录上调的机制，有待后续实验进一步研究。
