探讨百乐眠胶囊对失眠症小鼠的治疗机制。
ICR小鼠50只，按随机平行对照法分为正常对照组、模型组、百乐眠胶囊低、中、高剂量组共5组。百乐眠胶囊3个剂量组预防性灌胃给药14 d后，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)，建立失眠小鼠模型，造模后观察各组小鼠一般行为学并检测其脑组织中5–羟色胺(5–HT)和γ氨基丁酸(GABA)含量。另外两批ICR小鼠各50只，分别按随机平行对照法分为正常对照组、安定组、百乐眠胶囊低、中、高剂量组共5组，实验前禁食14 h，除正常对照组外分别进行安定或百乐眠灌胃给药；一批观察给药前及给药后30、60、120、240 min小鼠的一般行为，记录其5 min内活动次数；另一批给药30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠25 mg/kg，以翻正反射消失为睡眠指标，观察小鼠15 min入睡比例、睡眠潜伏期和总睡眠时间。
百乐眠胶囊中、高剂量组小鼠失眠症状显著改善，其脑组织中的5–HT和GABA含量均显著高于模型组[(164.6±12.8)、(193.2±25.6)比(147.1±15.5)ng/ml和(15.4±1.3)、(17.0±1.3)比(12.6±1.4)μmol/L ](均P<0.05)，且给药后120 min小鼠活动次数显著少于正常对照组[(91.3±10.4)、(78.5±12.7)比(150.7±10.8)次] (均P<0.05)。百乐眠低、中、高剂量均可提高小鼠15 min入睡比例，其睡眠潜伏期均短于正常对照组[(8.9±0.6)、(7.3±0.6)、(2.1±0.3)比0 min)]，总睡眠时间均长于正常对照组[(76.7 ±7.1)、(85.1±7.1)、(110.0±22.9)比0 min)](均P<0.05)。
百乐眠胶囊可以通过提高脑内5–HT和GABA含量来治疗失眠症。
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失眠症是指经常不能获得正常睡眠为特征的一种病症。祖国医学认为失眠症的成因与心、胆、肝、脾失和及情志等因素有关。现代研究表明，脑内5–羟色胺(5–HT)参与睡眠–觉醒周期调节，γ氨基丁酸(GABA)及其受体功能的改变参与睡眠觉醒过程及不同睡眠时相的转换，在睡眠调节中发挥重要作用[1]。百乐眠胶囊由百合、刺五加、首乌藤、合欢花、珍珠母、生石膏、酸枣仁、茯苓、远志等中药制成，其中百合、刺五加为君药，能滋阴清热、清心安神、疏肝解郁；首乌藤、合欢花、珍珠母、生石膏、酸枣仁、茯苓、远志为臣药，能辅佐君药、养血安神。本研究通过百乐眠胶囊对对氯苯丙氨酸致失眠模型小鼠的实验，探讨百乐眠胶囊治疗对失眠症的作用机制。
ICR小鼠150只，体重20～24 g，雌雄各半(扬州大学比较医学中心提供)。
百乐眠胶囊(扬子江药业集团有限公司，批号：14041611)；对氯苯丙氨酸(PCPA)(美国Sigma公司)；安定片(天津力生制药股份有限公司，批号：0602002)；5–HT酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：14062304)；GABA ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：14061502)。
根据百乐眠胶囊临床使用剂量及预实验结果，将百乐眠胶囊用量分为低、中、高剂量3组，分别剂量为0.72、0.36及0.18 g/kg。将0.81 g(3粒胶囊，0.27 g/粒)百乐眠溶解于10 ml生理盐水中制成混合溶液进行灌胃。
取50只小鼠，雌雄各半，用随机平行对照方法分为正常对照组、模型组、百乐眠胶囊低、中、高剂量组5组。百乐眠低、中、高剂量组预防灌胃给药14 d后，除正常对照组外均腹腔注射PCPA 350 mg/kg进行失眠小鼠造模，同时对正常对照组腹腔注射同等体积的生理盐水溶液，连续进行2 d[2,3,4]。
造模成功后，脱颈椎处死小鼠，在枕骨大孔处迅速剪断延髓，去颅骨，完全暴露脑组织，取出脑组织，在冰平皿上分离出大脑后，在冰冷生理盐水中洗去血液，组织称重后，在冰浴条件下充分匀浆，3 000 r/min离心10 min(离心半径10 cm)，取上清液，用ELISA试剂盒按说明书处理后，在酶标仪450 nm处检测5–HT和GABA含量。
采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析，正态分布的计量数据以
±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。
与正常对照组小鼠比较，腹腔注射对氯苯丙氨酸液后模型组小鼠出现明显失眠症状：活动频繁，对外界的声、光等刺激异常敏感，兴奋性增高，攻击性增强，昼夜节律紊乱，白天也活动不止。百乐眠胶囊低、中、高剂量组小鼠进食、饮水、排便和毛色变化无明显差异，失眠症状不明显；模型组小鼠脑组织中5–HT及GABA含量明显低于正常对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。百乐眠胶囊高、中剂量组小鼠脑组织中的5–HT及GABA含量明显高于模型组小鼠，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表1)。
各组小鼠脑组织中5–HT和GABA含量比较(
±s)
各组小鼠脑组织中5–HT和GABA含量比较(±s)
| 组别 | 只数 | 剂量(g/kg) | 5–HT(ng/ml) | GABA(μmol/L) | |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | – | 201.4±16.6 | 17.4±1.5 | |
| 模型组 | 10 | – | 147.1±15.5a | 12.6±1.4a | |
| 百乐眠胶囊组 | |||||
| 低剂量 | 10 | 0.18 | 148.9±34.8 | 14.7±1.5 | |
| 中剂量 | 10 | 0.36 | 164.6±12.8b | 15.4±1.3b | |
| 高剂量 | 10 | 0.72 | 193.2±25.6b | 17.0±1.3b | |
注：与正常对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01
灌服百乐眠后，百乐眠高剂量组在用药后60、120、240 min小鼠主动活动次数显著低于正常对照组，而百乐眠中剂量组在用药后120、240 min小鼠主动活动次数显著低于正常对照组差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中在给药后120 min时主动活动次数减至最少(表2)。
各组小鼠自主活动次数比较(次，
±s)
各组小鼠自主活动次数比较(次，±s)
| 组别 | 只数 | 剂量(g/kg) | 给药前 | 给药后 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 30 min | 60 min | 120 min | 240 min | |||||
| 正常对照组 | 10 | – | 155.3±9.4 | 149.9±5.4 | 140.6±9.6 | 150.7±10.8 | 141.9±8.7 | |
| 安定组 | 10 | 0.000 5 | 142.9±13.2 | 97.1±16.8a | 99.9±18.4a | 107.2±23.1a | 120.3±19.7b | |
| 百乐眠胶囊组 | ||||||||
| 低剂量 | 10 | 0.18 | 148.4±10.2 | 154.8±7.4 | 143.3±7.1 | 123.8±14.4 | 123.0±13.0 | |
| 中剂量 | 10 | 0.36 | 147.8±11.5 | 148.5±6.1 | 136.8±11.3 | 91.3±10.4b | 97.2±10.1b | |
| 高剂量 | 10 | 0.72 | 145.3±8.1 | 142.7±11.3 | 105.5±17.0b | 78.5±12.7a | 89.1±15.8a | |
注：与正常对照组比较，aP<0.01，bP<0.05
小鼠灌服百乐眠后，均表现出与戊巴比妥钠阈剂量的协同作用。百乐眠胶囊低、中、高剂量组均可提高小鼠15 min入睡比例，睡眠潜伏期比正常对照组短，总睡眠时间比正常对照组长，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表3)。
各组小鼠有关睡眠指标的比较(
±s)
各组小鼠有关睡眠指标的比较(±s)
| 组别 | 只数 | 剂量(g/kg) | 15 min入睡比例 | 睡眠潜伏期(min) | 总睡眠时间(min) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | – | 0/10 | 0 | 0 | |
| 安定组 | 10 | 0.000 5 | 10/10a | 5.7±0.4a | 289.5±26.0a | |
| 百乐眠胶囊组 | ||||||
| 低剂量 | 10 | 0.18 | 9/10a | 8.9±0.6a | 76.7 ±7.1a | |
| 中剂量 | 10 | 0.36 | 10/10a | 7.3±0.6a | 85.1 ±7.1a | |
| 高剂量 | 10 | 0.72 | 10/10a | 2.1±0.3a | 110.0±22.9a | |
注：与正常对照组比较，aP<0.01
研究证明百乐眠胶囊可以增高小鼠脑内5–HT及GABA含量，进而改善失眠症状，减少其自主活动次数、提高15 min内入睡比例，缩短睡眠潜伏期，延长总睡眠时间。对失眠症有一定的治疗作用。
失眠症是以入睡困难、易醒及早醒为特征的一种常见睡眠障碍，是睡眠数量和质量达不到正常需求的一种主观意念，在整夜睡眠监测中患者常表现为入睡潜伏期延长及总睡眠时间减少。因此治疗失眠的主要目的在于缩短睡眠潜伏期、延长总睡眠时间从而改善患者的睡眠质量[8]。百乐眠胶囊低、中、高剂量均可明显改善小鼠失眠症状，减少其自主活动次数、提高15 min内入睡比例，缩短睡眠潜伏期，延长总睡眠时间，这与既往临床研究相一致，刘万枫等[9]利用睡眠评定量表比较患者服用百乐眠治疗前后的症状改善情况，证实百乐眠可明显改善失眠症患者的睡眠质量。同时邹建东等[10]在多中心大样本病例对照研究中，通过匹茨堡睡眠质量指数量表，得出了相应的结果。可见无论是在动物实验还是在临床实验中百乐眠胶囊均可改善失眠患者的睡眠质量，对失眠症有一定的治疗作用。
目前，PCPA诱导失眠模型是国际公认的失眠模型，是研究5–HT及其与其他递质之间关系的经典动物模型。PCPA可以干扰5–HT的合成，影响动物正常睡眠–觉醒周期的效果。此法针对性较好，造模时间短，因此受到广泛的使用。脑内5–HT神经元合成5–HT过程主要在末梢中进行，色氨酸在色氨酸轻化酶的催化下生成5–羟色氨酸(5–HTP )，再经5–轻色氨酸脱梭酶的作用脱梭成为5–HT。大量研究资料表明脑内5–HT能系统参与睡眠–觉醒周期调节、心血管活动调节、精神情感活动和下丘脑–垂体的神经内分泌活动的调节。5–HT可明显改善睡眠质量[11]。GABA是中枢神经系统特有的物质，脑和脊髓外的组织含量极少，为中枢神经系统的最重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、吭惊厥、镇痛、调节内分泌等功能。GABA及其受体功能的改变参与睡眠觉醒过程及不同睡眠时相的转换，在睡眠调节中发挥重要作用。GABA含量的增加对兴奋性和抑制性传导的平衡起着关键作用，进而间接导致对睡眠发生产生特殊影响，改善睡眠质量[12,13,14]。可见百乐眠正是通过增加5–HT和GABA在脑内的含量达到改善失眠患者睡眠质量的作用。
从中医角度而言，百乐眠胶囊中百合、刺五加为君药，具有滋阴清热、清心安神、益气健脾、补肾安神的作用；首乌藤、合欢花、珍珠母、生石膏、酸枣仁、茯苓、远志为臣药，协助君药，可增强宁心安神之力；玄参、地黄、麦冬、五味子为佐药，具有滋阴养血除烦躁，补肾养心功效；灯心草、丹参为使药，可助群药之力，走而不守，诸药协同，共奏滋阴清热、宁心安神之功效。
综上所述，百乐眠胶囊可以通过增加5–HT和GABA在脑内的含量起到对失眠症的治疗作用。
