探讨帕金森病(PD)患者外周血T、B淋巴细胞亚群指标的变化规律，评估其作为PD诊断及病情评估的生物学标记的价值。
以2013年3月至2014年6月从中山大学附属第一医院神经科门诊/住院77例PD患者及体检中心82名健康老年人为研究对象。流式细胞术检测研究对象外周血中CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD19＋淋巴细胞亚群百分比，t检验比较两组差异，多元线性回归分析PD组淋巴细胞亚群与其病程、病情严重程度及其药物剂量的相关性。
PD患者外周血CD3＋、CD3＋CD4＋T淋巴细胞百分比较对照组明显降低[(62±12)%比(66±9)%，P＝0.04；(35±9)%比(38±7)%，P＝0.02]，尤其男性患者[(66±9)%比(61±13)%，P＝0.02；(38±10)%比(33±9)%，P＝0.01]。男性患者外周血CD3＋T淋巴细胞百分比与其病程呈正相关(r＝0.329，P＝0.013，回归系数为1.423)。女性患者外周血CD3＋CD8＋T淋巴细胞百分比则与其病程呈负相关、与非运动症状评分呈正相关(r＝–0.309，P＝0.045；r＝0.370，P＝0.020；回归系数分别为–0.354，0.486)。
PD患者外周血的T淋巴细胞亚群比例失调，且存在性别差异。外周血淋巴细胞比例的变化可能有助于PD诊断及其病情进展的评估。
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帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的神经退行性病，其发病机制仍未完全明了，可能为遗传、环境毒素及免疫紊乱等多因素相互作用所致。临床上，PD患者中脑黑质多巴胺能(dopaminergic, DA)神经元丢失80%才出现症状，故寻找支持本病诊断及病情评估的生物学标志物具有重要临床意义。近年来，免疫紊乱已成为PD发病及其病情进展的研究热点[1]。Brochard等[2]发现，PD患者黑质区CD4＋T、CD8＋T淋巴细胞聚集，CD4＋T细胞通过Fas/FasL通路影响DA神经元凋亡。Cebrián等[3]发现，儿茶酚胺类神经元易受CD4＋T细胞攻击。Benner等[4]在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)模型鼠中证实，α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)可诱导动物颈淋巴结内发生淋巴细胞聚集，将α-syn处理后的小鼠外周血淋巴细胞输入模型鼠后，可加剧后者DA神经元变性。这些研究均提示，外周血淋巴细胞亚群与PD的发生、发展存在密切关系。而且，PD患者中存在血脑屏障功能障碍，α-syn可从脑组织逸出至血液，影响其外周免疫系统[5]。近年来，国内外对外周血淋巴细胞亚群与PD的关系已有研究，但结果并不一致。因此，本研究拟通过病例-对照及多元线性回归分析，探讨PD患者淋巴细胞亚群在外周血中的比例变化规律，并评估其是否为潜在的简便的病情评估的辅助方法。
本研究经中山大学附属第一医院伦理委员会批准。所有PD患者收集自2013年3月至2014年6月中山大学附属第一医院神经内科门诊部及住院部。PD组77例，诊断符合英国UK脑库标准[6]，其中男46例，女31例，总体平均年龄(59±8)岁，平均病程(5±5)年，Hoehn-Yahr(H-Y)分级平均(2±1)级，帕金森病统一评分量表Ⅲ(Unified Parkinson's disease rating scale Ⅲ，UPDRS Ⅲ)(22±19)分，非运动症状评价量表(Non-motor symptoms scale, NMSS)评分平均(8±5)分，左旋多巴等效剂量换算平均(630±391)mg。82名对照组来自医院体检中心健康老年人，其中男49名，女33名，平均年龄(61±9)岁，研究对象均签署知情同意书并排除自身免疫病、肿瘤、感染性疾病、血液系统疾病、吸烟史、酗酒史。
记录研究对象的性别、年龄，并对PD患者进行Hoehn-Yahr(H-Y)分级、帕金森病统一评分量表Ⅲ(UPDRS Ⅲ)、非运动症状评价量表(NMSS)评分，以及左旋多巴等效剂量换算。
外周血淋巴细胞比例测定：抽取研究对象静脉血5 ml，以流式细胞仪(BD FACSCalibur, BD Bioscience)检测CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T细胞及CD19＋细胞在外周血中的比例，在前散射和侧散射的二维Dot-plot图上，根据细胞内颗粒密度及大小选择淋巴细胞区，按荧光信号强度自动测算选定区域内相关单抗的阳性细胞百分比(Sigama)。
试验数据应用SPSS 13.0软件处理，计数资料以
±s表示，检测并转换正态分布后，以分层分析及t检验比较PD患者和健康对照之间的差异；分层分析及多元线性回归模型评估PD患者外周血细胞免疫指标与性别、病程、H-Y分级、UPDRS Ⅲ评分、NMSS评分、左旋多巴等效剂量的相关性，计算95%可信区间(95%CI)及P值，P<0.05视为差异有统计学意义。
我们的数据显示，PD组CD3＋、CD3＋CD4＋淋巴细胞百分比明显降低(P＝0.04, P＝0.02)，但CD3＋CD8＋淋巴细胞百分比却高于对照组，且CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋、CD19＋淋巴细胞百分比也低于对照组，其差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
对照组与PD组的外周血淋巴细胞亚群百分比(
±s)
对照组与PD组的外周血淋巴细胞亚群百分比(±s)
| 组别 | 例数 | CD3＋(%) | CD3＋CD4＋(%) | CD3＋CD8＋(%) | CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋ | CD19＋(%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 82 | 66±9 | 38±7 | 24±7 | 1.8±0.7 | 12±4 |
| PD组 | 77 | 62±12a | 35±9a | 24±8 | 1.6±0.7 | 12±5 |
注：aP<0.05
通过性别比较发现，与对照组相比，男性PD患者CD3＋、CD3＋CD4＋淋巴细胞亚群的百分比明显低于同性别对照组(P＝0.02, P＝0.01)，但女性PD患者淋巴细胞亚群的百分比与同性别对照组相比，其差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。
对照组与PD组的外周淋巴细胞亚群百分比的性别比较(
±s)
对照组与PD组的外周淋巴细胞亚群百分比的性别比较(±s)
| 组别 | 例数 | CD3＋(%) | CD3＋CD4＋(%) | CD3＋CD8＋(%) | CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋ | CD19＋(%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 男性对照组 | 49 | 66±9 | 38±10 | 24±6 | 1.7±0.7 | 12±4 |
| 男性PD组 | 46 | 61±13a | 33±9a | 25±9 | 1.5±0.7 | 12±6 |
| 女性对照组 | 33 | 66±9 | 38±7 | 24±8 | 1.8±0.9 | 13±4 |
| 女性PD组 | 31 | 64±9 | 37±8 | 24±7 | 1.7±0.8 | 12±5 |
注：与男性对照组比较，aP<0.05
对所有PD患者外周血T、B淋巴细胞亚群的百分比进行系统分析，发现其与病程、病情严重程度及左旋多巴等效剂量均无显著性相关(P>0.05)(表3)。
PD组内外周淋巴细胞亚群百分比与病程及左旋多巴等效剂量的相关性
PD组内外周淋巴细胞亚群百分比与病程及左旋多巴等效剂量的相关性
| 外周血淋巴细胞亚群 | 病程 | H-Y分级 | UPDRS Ⅲ评分 | NMSS评分 | 左旋多巴等效剂量 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| R2值 | P值 | R2值 | P值 | R2值 | P值 | R2值 | P值 | R2值 | P值 | |
| CD3＋(%) | –0.005 | 0.43 | 0.004 | 0.57 | 0.002 | 0.73 | –0.010 | 0.63 | 0.012 | 0.34 |
| CD3＋CD4＋(%) | 0.011 | 0.35 | –0.013 | 0.98 | –0.011 | 0.69 | –0.008 | 0.52 | 0.000 | 0.34 |
| CD3＋CD8＋(%) | –0.008 | 0.54 | –0.013 | 0.96 | –0.011 | 0.70 | 0.004 | 0.25 | –0.008 | 0.54 |
| CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋ | 0.002 | 0.68 | 0.001 | 0.79 | 0.000 | 0.92 | 0.000 | 0.85 | 0.012 | 0.35 |
| CD19＋(%) | 0.021 | 0.21 | 0.014 | 0.31 | –0.009 | 0.59 | –0.006 | 0.47 | 0.006 | 0.49 |
注：此处R2为调整校正后的值
然而，性别分层分析后发现，男性PD患者外周血CD3＋T淋巴细胞百分比与其病程呈正相关(Pearson相关系数r＝0.329，P＝0.013)(表4)，多元线性回归模型为：y(CD3＋ T)＝54.089＋1.423x(病程)，该模型复相关系数：r＝0.329，P＝0.026。女性PD患者外周血CD3＋CD8＋T淋巴细胞百分比与其病程呈负相关，与非运动症状评分则呈正相关(Pearson相关系数r＝–0.309, P＝0.045；r＝0.370, P＝0.020)(表5)，多元线性回归模型为：y(CD3＋CD8＋T)＝21.049–0.354x1(病程)＋0.486x2(NMSS评分)，该模型复相关系数R＝0.493，P＝0.058。其余淋巴细胞指标与病程、病情严重程度、左旋多巴等效剂量无明显相关性(P>0.05)(表4，表5)。
男性患者血淋巴细胞亚群与PD病情程度及左旋多巴等效剂量的相关性
男性患者血淋巴细胞亚群与PD病情程度及左旋多巴等效剂量的相关性
| 外周血淋巴细胞亚群 | 病程 | H-Y分级 | UPDRS评分 | NMSS评分 | 左旋多巴等效剂量 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | |
| CD3＋(%) | 0.329 | 0.013 | 0.084 | 0.29 | 0.052 | 0.37 | –0.074 | 0.31 | –0.051 | 0.37 |
| CD3＋CD4＋(%) | 0.171 | 0.13 | 0.095 | 0.26 | 0.204 | 0.09 | 0.155 | 0.14 | 0.031 | 0.42 |
| CD3＋CD8＋(%) | 0.168 | 0.13 | 0.005 | 0.49 | –0.023 | 0.44 | 0.026 | 0.43 | –0.069 | 0.32 |
| CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋ | –0.095 | 0.27 | 0.000 | 0.50 | 0.113 | 0.23 | 0.124 | 0.21 | 0.176 | 0.12 |
| CD19＋(%) | 0.147 | 0.17 | 0.108 | 0.24 | 0.149 | 0.16 | –0.028 | 0.43 | 0.152 | 0.16 |
女性患者血淋巴细胞亚群与PD病情程度及左旋多巴等效剂量的相关性
女性患者血淋巴细胞亚群与PD病情程度及左旋多巴等效剂量的相关性
| 外周血淋巴细胞亚群 | 病程 | H-Y分级 | UPDRS评分 | NMSS评分 | 左旋多巴等效剂量 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | r值 | P值 | |
| CD3＋(%) | –0.136 | 0.23 | 0.060 | 0.38 | 0.054 | 0.39 | –0.090 | 0.32 | –0.108 | 0.28 |
| CD3＋CD4＋(%) | 0.067 | 0.36 | –0.136 | 0.24 | –0.223 | 0.11 | –0.116 | 0.15 | –0.243 | 0.09 |
| CD3＋CD8＋(%) | –0.309 | 0.045 | –0.002 | 0.50 | 0.171 | 0.18 | 0.370 | 0.020 | –0.163 | 0.19 |
| CD3＋CD4＋/CD3＋CD8＋ | 0.227 | 0.11 | –0.028 | 0.44 | –0.091 | 0.31 | –0.262 | 0.08 | 0.014 | 0.47 |
| CD19＋(%) | 0.170 | 0.18 | 0.137 | 0.23 | –0.104 | 0.29 | –0.189 | 0.15 | –0.053 | 0.39 |
近年研究表明，免疫紊乱机制参与了PD的发生、发展，不同淋巴细胞亚群在PD细胞和体液免疫紊乱过程发挥不同作用，检测患者外周血淋巴细胞亚群的变化，在一定程度上可能反映PD患者的免疫功能紊乱[7]。Fiszer等[8]报道，PD患者外周血CD4＋T细胞中的记忆T细胞比例增多，而幼稚T细胞减少。Bas等[9]发现，PD患者外周血T辅助细胞减少而调节型T细胞(CD4＋CD25＋)增多。雷革胜等[10]报道，PD患者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋T淋巴细胞水平较对照组下降。Saunders等[11]指出，PD患者外周血T淋巴细胞总计数减少。Stevens等[12]也报道，PD患者外周血T辅助细胞及B淋巴细胞减少。这些不完全一致的研究结果，反映了不同人种的PD患者外周血中可能出现不同的T淋巴细胞亚群变化。虽然PD患者外周T淋巴细胞亚群的变化规律并不一致，但反映了PD的发生、发展与机体免疫紊乱机制的相互作用关系。本研究的结果也显示，PD组CD3＋、CD3＋CD4＋淋巴细胞亚群比例较对照组明显降低，证实PD患者外周T淋巴细胞亚群在疾病发生、发展过程中发生了改变。与其他研究相比，本研究通过性别分层分析，进一步发现，男性PD患者CD3＋、CD3＋CD4＋淋巴细胞百分比较同性别对照组降低，而女性PD患者中则无相似改变，提示不同性别PD患者外周血的T淋巴细胞亚群的比例变化，可能存在性别差异。
关于PD病情进展的免疫失调机制，有报道推测，DA神经元凋亡后，向免疫系统提呈抗原，诱导血T、B淋巴细胞进入脑组织，激活小胶质细胞引发炎性反应，即外周血淋巴细胞亚群参与了PD的发生、发展[13]。PD患者的外周血T淋巴细胞亚群比例失调与其病情程度正相关，可能为炎性扩散导致淋巴细胞的数目及其比例失调所致。Ciaramella等[14]发现，外周血树突状细胞计数在PD患者中降低，并与患者的认知功能下降、伴躯体症状的抑郁及运动障碍症状严重程度等密切有关。Kim等[15]指出，外周CD4＋CD25＋T细胞失调可能参与了神经退行性病的抑郁症的行为学表现。Saunders等[11]认为，效应T细胞激活、或调节型T细胞功能受损与PD患者病变程度尤其是运动障碍症状进展有关。Stevens等[12]报道，PD患者外周血CD4＋T淋巴细胞水平与其病情评估的H-Y分级和UPDRS评分呈负相关，CD19＋B淋巴细胞水平则与H-Y分级负相关，且PD患者的免疫紊乱持续进展。
然而，本研究对PD患者淋巴细胞亚群数据进行初步的总体分析时，并未发现其与病程存在相关性。通过性别分层分析，却发现PD男性患者，其CD3＋T淋巴细胞亚群水平与其病程进展呈正相关，女性患者外周血CD3＋CD8＋T淋巴细胞亚群水平与其病程呈负相关，与非运动症状程度则呈正相关，说明不同性别PD患者病程进展时，其淋巴细胞亚群的数目或比例的变化，可能反映了机体免疫系统在两性间的差异。据报道，雌激素受体可在外周血淋巴细胞中表达。雌激素可对外周血T、B淋巴细胞、NK细胞及炎性因子等发挥功能复杂的调控作用，如17β雌二醇可显著增强T淋巴细胞的增殖[16]。雌二醇调控CD4＋CD25＋调节性T细胞的分泌功能，以减轻机体的炎性反应[17,18]，并能减少白细胞进入中枢神经系统[18]。迄今为止，虽然雌激素对PD患者外周血淋巴细胞亚群的调控机制尚不完全清楚，其对淋巴细胞在脑组织迁移的作用也不十分明确，但本研究的结果提示，PD患者外周血T淋巴细胞亚群的变化，的确存在性别差异，其机制需要进一步探讨。本研究显示，女性PD患者淋巴细胞亚群指标与非运动症状的进展程度相关，可能与雌激素对去甲肾上腺素能神经元[19]及其免疫系统的调控有关。
Kipnis等[20]指出，T淋巴细胞存在5种DA亚受体，多巴胺替代治疗可通过下调调节性T细胞的活性，减轻自身免疫反应而产生重要的神经保护作用。雷革胜等[10]发现，经左旋多巴治疗后，PD患者外周血CD3＋及CD8＋细胞的百分比较治疗前升高，提出左旋多巴治疗有利于纠正其免疫细胞的比例失常。但本研究结果显示，PD组外周血淋巴细胞亚群指标在服药后并无明显改善，暂未发现多巴胺替代治疗能纠正患者免疫系统紊乱。总之，本研究的结果提示，男性PD患者的外周血CD3＋T淋巴细胞百分比变化，以及女性PD患者的外周血CD3＋CD8＋T淋巴细胞百分比改变，均有助于协助PD诊断及评估病情进展。
