通过对运动神经元生存基因1(SMN1)部分缺失的脊髓性肌萎缩症(SMA)病例进行分析，探讨SMN1基因突变的多样性。
采用多重连接探针扩增(MLPA)技术分析2011至2013年期间在首都儿科研究所遗传研究室进行基因诊断的7例临床疑似SMA患儿的SMN基因拷贝数。选取SMN1和SMN2基因均为2拷贝的样品作为阴性对照，SMN1基因0拷贝同时SMN2基因2拷贝的样品为阳性对照。应用Coffalyser(版本22.02.2012)软件分析处理MLPA结果。根据MLPA试剂盒的说明判定SMN1和SMN2基因外显子7、8，以及SMN基因(SMN1＋SMN2)外显子1、4、6、8的拷贝数。
7例SMA患儿的SMN1基因均发生了部分缺失。部分缺失类型共分为两种，类型一为SMN1基因仅外显子7缺失，类型二为SMN1基因外显子1、4、7缺失。两种类型的部分缺失均包含了SMN1基因外显子7的缺失。
SMN1基因部分缺失进一步表明SMN基因结构不稳定。SMN1基因外显子7的缺失为SMA发病的主要原因。
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脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是常染色体隐性遗传性神经肌肉病。主要表现为脊髓前角运动神经元变性导致的进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力和萎缩。SMA发病率为1/6 000～1/10 000[1]。根据患儿的发病年龄及运动功能获得情况，可将SMA分为Ⅰ～Ⅲ型[1,2]。Ⅰ型通常在0～6个月发病，患儿不会坐。Ⅱ型为7～18个月发病，患儿会坐，但不会走。Ⅲ型通常18个月以后发病，患儿可以独立行走。SMA目前尚无有效的治疗办法。SMA的致病基因为运动神经元生存基因1(survival motor neuron gene，SMN1)，位于染色体5q13。SMN1基因有一个与其高度同源的拷贝––SMN2基因，两者基因组序列仅有5个碱基的差异，具有区分两者的检测意义。SMN1基因表达有功能的全长蛋白，而SMN2基因只表达10%～20%的全长蛋白，大部分为跳跃外显子7的不稳定的截短蛋白[3,4]。SMA患儿中约有80%～95%为SMN1基因的纯合缺失。缺失病例中基本为SMN1基因的完整缺失，也有文献报道了SMN1基因发生部分缺失。本研究应用多重连接探针扩增(multiplex ligation–dependent probe amplification, MLPA)技术发现的7例SMN1基因部分缺失的病例，报道如下。
2011至2013年期间在首都儿科研究所遗传研究室进行基因诊断的7例临床疑似SMA病例。样本采集经患儿父母知情同意，本研究经首都儿科研究所伦理委员会批准。
收集7例临床疑似SMA患儿外周静脉EDTA抗凝血，酚–氯仿法抽提DNA，Tris–EDTA溶解，NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，Milano，意大利)测定DNA浓度，–20 ℃保存。
将患儿基因组DNA稀释至40 ng/μl，取5 μl用于MLPA检测。参照SMA MLPA检测试剂盒(SALSA MLPA kit P021–A2，MRC，荷兰)的操作说明依次进行MLPA，包括：DNA变性、探针杂交、连接反应和PCR扩增反应。MLPA试剂盒包括SMN1基因外显子7、8，SMN2基因外显子7、8，SMN基因(SMN1和SMN2)的外显子1、4、6、8以及不同染色体上的参照基因共46对探针。获得MLPA产物后，应用ABI公司的3730XL自动化序列分析仪进行扩增片段的分离、峰高和峰面积的检测。选取3个SMN1和SMN2基因拷贝数均为2的样品作为阴性对照。选取2个SMN1基因0拷贝同时SMN2基因2拷贝的样品作为阳性对照。所有的样品均检测2次。
应用Coffalyser(版本：22.02.2012)软件分析MLPA结果。其原理是将待测样品的探针的峰高、峰面积校正后，与阴性对照样品的相同探针的峰高、峰面积相比，获得最终的比值(Ratio值)。应用Excel软件进行Ratio值的均数的计算。根据试剂盒的说明推测SMN1和SMN2基因外显子7、8的拷贝数：Ratio值<0.7时拷贝数为1，0.7 ≤Ratio值<1.3时拷贝数为2，1.3≤Ratio值<1.7时拷贝数为3，1.7≤Ratio值<2.3时拷贝数为4。推测SMN基因(SMN1＋SMN2)外显子1、4、6、8的拷贝数：Ratio值<0.4时拷贝数为1，0.4≤Ratio值<0.7时拷贝数为2，0.7≤Ratio值<0.9时拷贝数为3，0.9≤Ratio值<1.1时拷贝数为4。
为防止因SMN基因序列发生点突变，导致MLPA探针不能匹配，扩增无效而误判结果，针对MLPA试剂盒中的SMN基因外显子1、4、6探针和SMN1基因外显子7探针的序列，应用Primer Express 3.0软件分别设计4对引物扩增这7例病例样本，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送诺赛公司进行序列分析。获得基因组测序结果后，将探针结合部位的序列与参考序列进行比对，检查是否存在影响探针结合的突变位点，而影响MLPA结果的真实性。
7例病例进行MLPA检测，依据Ratio值获得的基因拷贝数见表1。健康对照个体SMN基因外显子1、4、6、8的总拷贝数均为4；SMN1和SMN2基因外显子7、8的拷贝数均为2。
7例疑似SMA患儿的MLPA结果(Ratio值为平均数，n＝2)
7例疑似SMA患儿的MLPA结果(Ratio值为平均数，n＝2)
| 病例序号 | SMN1基因 | SMN2基因 | SMN1基因＋SMN2基因 | |||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 外显子7 | 外显子8 | 外显子7 | 外显子8 | 外显子1 | 外显子4 | 外显子6 | 外显子8 | |||||||||
| 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | 拷贝数 | Ratio值 | |
| 1 | 0 | 0.000 | 1 | 0.605 | 2 | 1.235 | 2 | 0.970 | 3 | 0.785 | 3 | 0.745 | 3 | 0.770 | 3 | 0.785 |
| 2 | 0 | 0.000 | 1 | 0.660 | 2 | 1.235 | 2 | 1.045 | 3 | 0.875 | 3 | 0.890 | 3 | 0.795 | 3 | 0.795 |
| 3 | 0 | 0.000 | 1 | 0.665 | 2 | 1.040 | 2 | 0.965 | 3 | 0.875 | 3 | 0.880 | 3 | 0.800 | 3 | 0.845 |
| 4 | 0 | 0.000 | 2 | 1.030 | 2 | 1.220 | 1 | 0.645 | 3 | 0.825 | 3 | 0.890 | 3 | 0.800 | 3 | 0.830 |
| 5 | 0 | 0.000 | 2 | 1.025 | 2 | 1.295 | 1 | 0.590 | 3 | 0.725 | 3 | 0.790 | 3 | 0.790 | 3 | 0.800 |
| 6 | 0 | 0.000 | 0 | 0.015 | 2 | 0.855 | 4 | 2.180 | 2 | 0.495 | 2 | 0.560 | 4 | 1.040 | 4 | 1.090 |
| 7 | 0 | 0.045 | 0 | 0.050 | 2 | 1.170 | 4 | 2.040 | 3 | 0.735 | 3 | 0.760 | 4 | 1.080 | 4 | 1.125 |
注：SMA：脊髓性肌萎缩症；MLPA：多重链接探针扩增；SMN：运动神经元生存基因；Ratio值：待测样品与阴性对照样品的相同探针的峰高、峰面积的比值
病例1、2、3的MLPA结果一致：SMN基因外显子1、4、6、8的总拷贝数均为3；而SMN1与SMN2基因外显子7的拷贝数之比为0∶2，外显子8的拷贝数之比为1∶2。这3个病例一个SMN1等位基因外显子1～8全部缺失，另一个SMN1等位基因只缺失外显子7。SMN2为2个完整的等位基因。
病例4和5的拷贝数结果相同：SMN基因外显子1、4、6、8的总拷贝数均为3；而SMN1与SMN2基因外显子7的拷贝数之比为0∶2，外显子8的拷贝数之比为2∶1。这2个病例的一个SMN1等位基因外显子1～7全部缺失，外显子8保留；另一个SMN1等位基因只缺失外显子7。SMN2为2个不缺失的等位基因。其中，外显子8发生了1个SMN2向SMN1的转换，所以两者比例为2∶1。
病例6的SMN基因外显子1、4、6、8的拷贝数分别为2、2、4、4；而SMN1与SMN2基因外显子7的拷贝数之比为0∶2，外显子8的拷贝数之比为0∶4。这个病例的两个SMN1等位基因均发生了外显子1、4、7的纯合缺失，SMN1外显子8均转换为SMN2外显子8。SMN2基因的外显子1、4、6、7、8均无缺失。
病例7的SMN基因外显子1、4、6、8的拷贝数分别为3、3、4、4；而SMN1与SMN2基因外显子7的拷贝数之比为0∶2，外显子8的拷贝数之比为0∶4。该病例一个SMN1等位基因发生了外显子1、4、7的缺失，另一个SMN1等位基因只有外显子7缺失，SMN1外显子8均转换为SMN2外显子8。SMN2外显子1、4、6、7、8均无缺失。
以上7例疑似病例经MLPA分析后，确定两种SMN1基因部分缺失类型：仅缺失外显子7和缺失外显子1、4、7。7例均为SMN1基因外显子7的纯合缺失，结合患儿的临床表现确诊为SMA。7例患儿的基本资料见表2。这7例患儿中最小发病年龄为4个月，最大发病年龄为3岁，其中临床分型Ⅱ型最多，共4例，Ⅰ型2例，Ⅲ型1例。
7例疑似SMA患儿的基本资料
7例疑似SMA患儿的基本资料
| 病例 | 发病年龄 | 性别 | 临床分型 | SMN1∶SMN2(外显子7拷贝数之比) | 基因型 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 等位基因2 | 等位基因1 | |||||
| 1 | 9个月 | 男 | Ⅰ | 0∶2 | 完整缺失 | 部分缺失1 |
| 2 | 1岁2个月 | 男 | Ⅱ | 0∶2 | 完整缺失 | 部分缺失1 |
| 3 | 11个月 | 男 | Ⅱ | 0∶2 | 完整缺失 | 部分缺失1 |
| 4 | 1岁7个月 | 男 | Ⅱ | 0∶2 | 完整缺失 | 部分缺失1 |
| 5 | 2岁 | 男 | Ⅲ | 0∶2 | 完整缺失 | 部分缺失1 |
| 6 | 4个月 | 男 | Ⅰ | 0∶2 | 部分缺失2 | 部分缺失2 |
| 7 | 3岁 | 女 | Ⅱ | 0∶2 | 部分缺失1 | 部分缺失2 |
注：部分缺失1：SMN1基因仅缺失外显子7；部分缺失2：SMN1基因缺失外显子1、4、7
根据表3中的引物，对7例病例进行PCR扩增测序，每例病例分别获得231、749、197、459 bp大小的片段，这些片段依次包含了SMN基因的外显子1、4、6及SMN1基因外显子7的MLPA探针序列(表3)。测序结果见图1。通过与SMN1基因参考序列(GenBank: NM_000344)进行比对，扩增产物的序列与参考序列的碱基排列一致，并不存在影响MLPA探针结合的突变。因此，MLPA所检测的拷贝数结果是可信的。
SMN基因外显子1、4、6及SMN1基因外显子7的引物序列及MLPA试剂盒相应探针序列
SMN基因外显子1、4、6及SMN1基因外显子7的引物序列及MLPA试剂盒相应探针序列
| 外显子 | 引物序列(5'→3') | 探针序列(5'→3') |
|---|---|---|
| 外显子1(SMN) | 上游GCGAGGCTCTGTCTCAAAAC | CCACAAATGTGGGAGGGCGAT |
| 下游CCCCGTCCCTTCTTAAGAGT | AACCACTCGTAGAAAGCGTGAGAAGTTACTACAAGCGGTCCTC | |
| 外显子4(SMN) | 上游TATCCTTCACCTCCCCACT | CAAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTCAAC |
| 下游GCATCATTATCTTATTTCCT | AGATGAAAGTGAGAACTCCAGGTCTCCTGGAAATAAATCAGAT | |
| 外显子6(SMN) | 上游CCAGACTTTACTTTTTTGTTTACTG | CTGATGATGCTGATGCTTTGGGAAGTATGT |
| 下游GTCAGGAAAAGATGCTGAGTG | TAATTTCATGGTACATGAGTGGCTATCATACTGGCTATTATAT | |
| 外显子7(SMN1) | 上游TGTCTTGTGAAACAAAATGCTT | CTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC |
| 下游AAAAGTCTGCTGGTTGCCTA | AGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTA |
SMA是较常见的单基因遗传病，主要由于SMN1基因纯合缺失所致。SMN1与SMN2基因高度同源，其所在的5q13区域还存在其他基因[5]，如：NAIP基因、GTF2H2基因，它们在该区域也存在同源序列。由于此区域的大量重复序列、假基因，使其结构不稳定，易于在高度同源的序列之间发生不均等的重组，从而导致基因缺失、复制或基因转换等。由于基因结构的特殊性，导致SMN基因的构成与缺失的多样性。
通过对7例病例进行MLPA拷贝数分析，我们对外显子7以外的其他基因位置有了一个直观的了解。根据7例病例MLPA的检测结果，本研究发现两种部分缺失类型：仅缺失外显子7和缺失外显子1、4、7。关于SMN1基因部分缺失的问题，国外已有一些相关报道，Arkblad等[6]在瑞典携带者人群中发现SMN1基因外显子1～6的缺失，并导致其子女患病。Clermont等[7]和Sun等[8]在研究中报道了外显子5、6的缺失。我们将7例部分缺失的病例分为3种基因型：基因型一为一个等位基因发生整个基因的缺失，另一个等位基因仅缺失外显子7(图2A)；基因型二为2个等位基因均缺失了外显子1、4、7(图2B)；基因型三为一个等位基因缺失外显子1、4、7，另一个等位基因仅缺失外显子7(图2C)。本研究部分缺失病例与国外的报道有所不同，这7例临床疑似SMA患儿，均发生了SMN1基因外显子7的纯合缺失，均保留了外显子6。SMN1基因外显子1～7，每个外显子编码的蛋白序列均有其特殊的功能[9]，外显子1和2编码K结构域，为SMN蛋白自身寡聚化和募集其他蛋白(如SIPI)的位点；外显子3编码Tudor结构域，是Sm蛋白结合并发挥生物功能的位点；外显子5和6编码的P结构域是与抑丝蛋白(profilin)的结合位点；外显子6还编码YG盒，它与SMN蛋白自身寡聚化有关。外显子7存在多个剪接元件[10,11]其中一个碱基置换(c.840C>T)，可以导致SMN2基因外显子剪接增强子(ESE)活性减弱、而剪接抑制子(ESS)活性增强，使得SMN2外显子7被剪接掉，产生跳跃外显子7的截短的SMN蛋白，而仅能表达10%～20%的全长SMN蛋白。因此外显子1～7的任一部分的缺失均能导致疾病发生，而外显子7为SMA发病更主要的因素。这为全面理解SMA的遗传异质性和表型差异性提供了参考。
研究显示，外显子8在SMN1和SMN2基因之间常常存在转换[12,13]。本研究中，SMN1基因与SMN2基因外显子8的拷贝数之比分为3种情况：1∶2、2∶1、0∶4，每个疾病个体至少存在1个拷贝的SMN2基因外显子8。研究显示，外显子8在转录后会被剪切掉，并不翻译，它的存在与否并不影响SMN蛋白的功能，因此当SMN1基因外显子7缺失而外显子8不缺失时，不能阻止疾病的发生[14]。基于上述两个原因，我们认为SMN1基因外显子8并不是疾病发生的影响因素。
SMA的基因诊断技术主要依据外显子7和外显子8的碱基差异位点，在区别两个基因的基础上做出基因缺失的诊断。如：PCR–酶切、等位基因特异PCR(AS–PCR)、基因组测序、实时(real–time)荧光定量PCR等。这些方法仅能发现外显子7上的突变，而不能反映基因其他部位拷贝数的改变。MLPA技术，不仅能区分SMN1基因与SMN2基因的外显子7、8，还包含有SMN基因(SMN1＋SMN2)外显子1、4、6、8的探针，可以发现基因完整缺失和基因内的部分缺失。它是目前较为公认的基因拷贝数检测方法，已经应用于多个领域、多种疾病的研究。相对其他传统诊断手段而言，MLPA技术是研究SMA基因拷贝数较适宜的技术。本研究应用基因组测序的方法，确认MLPA试剂盒所提供的SMN基因探针序列不存在多态位点而影响探针的结合，进而证实了MLPA结果的真实可靠。
综上所述，SMN基因结构不稳定，可表现为多种突变形式。但SMN1基因外显子7的缺失为SMA发病的主要原因。关于SMN1基因突变类型与临床表型的关系的研究，有待于后期扩大病例数，进一步研究。MLPA技术优于传统检测手段，可以发现基因内的部分缺失。
