探讨水通道蛋白4(AQP4)基因多态性与国人视神经脊髓炎(NMO)发病的遗传相关性及分子机制。
收集2010年1月至2014年1月在中山大学附属第三医院神经科就诊的血清AQP4抗体(NMO-IgG)阳性的NMO患者111例及NMO谱系疾病(NMOSD)患者97例和健康对照204名作为研究对象。首先，选择AQP4基因调控区的8个单核苷酸多态性位点(SNP)进行基因分型；之后，通过关联分析SNP基因基因型与NMO临床表型的相关性；最后，利用双荧光素酶检测技术验证3′-非翻译区(3′-UTR)SNP位点的碱基改变对小分子RNA(miRNA)调控作用的影响。
AQP4基因3′-UTR区rs1058424的A/T基因型(50.61%比70.45%, OR＝0.430, 95%CI 0.210～0.880)和rs3763043的C/T基因型(50.00%比68.18%, OR＝0.467, 95%CI 0.231～0.994)与长节段脊髓炎，3′-UTR区rs1058424的A/T基因型(46.72%比66.28%, OR＝0.525，95%CI 0.276～0.999)、rs335929的A/C基因型(45.08%比58.14%, OR＝0.527, 95%CI 0.281～0.987)和启动子0区rs151244的C/T基因型(50.82%比69.77%, OR＝0.450, 95%CI 0.230～0.881)与视神经炎，3′-UTR区rs6508459及内含子区rs3763040基因型与合并系统性自身免疫性疾病存在相关性(P分别为0.012和0.023)；miRNA 323-3p对AQP4基因表达有调控作用，但3′-UTR区rs1058424碱基改变并不影响miRNA 323-3p对AQP4基因的调控。
AQP4基因3′-UTR区的SNP与国人NMO临床表型具有相关性。miRNA 323-3p可能通过与AQP4基因3′-UTR区某一特定SNP位点结合起调节作用，从而参与NMO发病。
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视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一种以反复发作的视神经炎和长节段脊髓炎为特点的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。NMO患者外周血中存在着水通道蛋白4(AQP4)特异性抗体(即NMO-IgG)[1]。视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)是一类与血清NMO-IgG阳性有关的临床综合征[1]。NMO-IgG与星形胶质细胞足突上的AQP4特异性结合，激活补体依赖的免疫反应，最终导致星形胶质细胞损伤、髓鞘脱失以及轴索损伤[2]，是NMO及NMOSD的重要发病机制。AQP4存在M1和M23两种蛋白异构体，M23可以形成正交排列结构(orthogonal arrays of particles，OAP)，而M1不形成OAP结构。目前认为OAP结构的形成是NMO-IgG起病理作用的先决条件[3]。
血清NMO-IgG阳性患者的临床表现并不相同。例如，部分患者表现为典型NMO病程，部分患者仅表现为脊髓炎或视神经炎，部分患者可合并有颅内病变或自身免疫性疾病。各临床表型的发病机制可能均与NMO-IgG相关，所以推测它们存在着共同的易感基因，但对于是否是不同的基因位点导致不同的临床表型，目前国内外尚罕见相关研究。
人类AQP4基因在编码区较保守，在非翻译区(untranslated regions, UTR)，包括5′-UTR和3′-UTR区，则存在多个单核苷酸多态性(SNP)位点[4]。我们前期研究表明，AQP4基因启动区及3′-UTR区的碱基变异可能与NMO发病相关[5,6]。根据3′-UTR区的功能特点，我们推测AQP4基因3′-UTR区SNP碱基改变可能影响与相应小分子RNA(miRNA)的结合，导致AQP4 M1和M23两种异构体的表达失衡(OAP结构大小或数量改变)，诱导NMO-IgG形成。本研究将对AQP4基因的8个SNP基因型与NMO临床表型进行关联分析，并进一步验证3′-UTR区的SNP的碱基变异对miRNA功能的影响。
连续收集2010年1月至2014年1月在中山大学附属第三医院神经科南方汉族患者，包括111例NMO和97例NMOSD，NMO诊断参照参考2006年Wingerchuk诊断标准[1]，NMOSD参考2007年Wingerchuk诊断标准[1]；所有患者均通过间接免疫荧光法检测[7]血清NMO-IgG阳性。对照组为204名中国南方健康人。本研究得到中山大学附属第三医院伦理委员会批准(伦理批号：[2007]33号)，所有入组成员均已签订知情同意书。
将患者按以下条件分组：长节段脊髓炎组(TM1组)，无长节段脊髓炎组(TM0组)；视神经炎组(ON1组)，无视神经炎组(ON0组)；合并脑部病灶组(CR1组)，无脑部病灶组(CR0组)；合并系统性自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮、干燥综合征、强直性脊柱炎)组(AI1组)，不合并组(AI0组)。病例组及对照组基本信息见表1。
病例组及对照组基本信息
病例组及对照组基本信息
| 组别 | 亚组 | 例数 | NMO/NMOSD(例) | 性别(男/女) | 年龄[岁，(中位数，范围)] |
|---|---|---|---|---|---|
| 病例组 | 208 | 111/97 | 9/199 | 41(3～75) | |
| TM0 | 44 | 0/44 | 4/40 | 33(3～59) | |
| TM1 | 164 | 111/53 | 5/159 | 41(12～75) | |
| ON0 | 86 | 0/86 | 4/82 | 41(3～75) | |
| ON1 | 122 | 111/11 | 5/117 | 40(14～73) | |
| CR0 | 188 | 109/79 | 8/180 | 41(3～75) | |
| CR1 | 20 | 2/18 | 1/19 | 31(13～56) | |
| AI0 | 203 | 109/94 | 9/194 | 40(3～75) | |
| AI1 | 5 | 2/3 | 0/5 | 42(40～51) | |
| 对照组 | 204 | – | 26/178 | 30(21～40) |
注：TM0：无长节段脊髓炎组；TM1：长节段脊髓炎组；ON0：无视神经炎组；ON1：视神经炎组；CR0：无脑部病灶组；CR1：合并脑部病灶组；AI0：不合并组；AI1：合并系统性自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮、干燥综合征、强直性脊柱炎)组
参考我们课题组前期测序结果[5,6]，选择rs151244、rs1058424和rs3763043作为目标SNP;同时使用软件Haploview 4.2，参考以下标准在AQP4的常见SNP中选择5个目标SNP：最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)≥0.05，r2>0.8，每一个连锁不平衡模块中至少有一个目标SNP。目标SNP的基本信息见表2。
目标SNP及其基本信息a
目标SNP及其基本信息a
| 参考 | SNP | AQP4基因位置b | 染色体位置 | 等位基因 |
|---|---|---|---|---|
| Mai等[5] | rs151244 | Promoter 0 | 24446719 | C/T |
| 邱伟等[6] | rs1058424 | 3′-UTR | 24435545 | A/T |
| rs3763043 | 3′-UTR | 24435818 | C/T | |
| Haploview 4.2软件 | rs335929 | 3′-UTR | 24435587 | A/C |
| rs6508459 | 3′-UTR | 24427303 | G/A | |
| rs3763040 | Intron1 | 24444374 | G/A | |
| rs2075575 | Intron1 | 24446526 | G/A | |
| rs162007 | Intron1 | 24445847 | G/A |
注：SNP：单核苷酸多态性；Exon，外显子；Intron，内含子；Promoter，启动子；3′-UTR，3′非翻译区；a参考HapMap数据库(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)；b参考mRNA序列：NM_001650.4
留取乙二胺四乙酸抗凝血2～4 ml，采用酚氯仿法提取外周血白细胞DNA，利用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，–20 ℃保存。检测时取DNA样本1 μl，应用1%琼脂糖电泳对其进行质量检查以及浓度估计，之后将样本稀释到工作浓度(5～10 ng/μl)。
取iMLDR™多重SNP分型试剂盒中的多重PCR引物混合物1 μl、2×PCR预混液5 μl、3 μl蒸馏水与1 μl样本DNA，混匀。PCR热循环参数：预变性，95 ℃ 2 min；变性，94 ℃ 20 s；退火，65～58 ℃每循环1次降0.5 ℃ 40 s；延伸，72 ℃ 1 min 30 s，扩增11个循环；变性，94 ℃ 20 s；退火，59 ℃ 30 s，扩增24个循环；72 ℃ 2 min，降温至4 ℃。在PCR产物中加入外切核酸酶Ⅰ/虾碱酶1 μl，37 ℃温浴1 h，然后75 ℃灭活15 min。取试剂盒中的10×连接缓冲液2 μl、高温连接酶0.2 μl、连接引物混合液1 μl与纯化后的多重PCR产物3 μl、蒸馏水3.8 μl，混匀。连接反应参数：94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，35个循环；降温至4 ℃。
取0.5 μl连接产物，与0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD、9 μl Hi-Di混匀，95 ℃变性5 min后上ABI3130XL测序仪。使用GeneMapper4.0软件(Applied Biosystems，美国)分析。
使用分析软件SAS 9.1。采用χ2检验比较基因型频率在病例组和对照组之间的差异，P>0.05则认为差异具有统计学意义；采用非条件Logistic回归分析评估各基因型与NMO各亚型发生风险的相关程度，OR及其95%CI均>1则认为该基因型或单倍体型为发病的危险因素。
通过对TargetScan数据库(www.targetscan.org)的查询，发现AQP4基因3′-UTR区存在26个潜在的miRNA结合靶位点。进一步分析发现AQP4基因3′-UTR的SNP(rs1058424)位于与hsa-miR-323-3p的"种子序列"互补结合的区域内，因此我们假设，AQP4基因3′-UTR区rs1058424 (U-A)SNP改变可能会影响其与miR-323-3P的结合。
在海参荧光素酶报告基因(hRluc)下游插入待AQP4基因的3′-UTR区域；同时构建AQP4基因3′-UTR突变体载体作为对照，载体上有萤火虫荧光素酶基因(hluc)作为稳定表达的内参。
使用阳离子脂质体法进行细胞转染。细胞按2×104个/孔接种于24孔板上，培养基为含10%FBS的DMEM-高糖培养基；吸去旧培养基，PBS洗涤两次，每孔加入300 μl OPTI-MEM(Invitrogen，美国)培养基，置于5% CO2、37 ℃培养箱中。每孔用OPTI-MEM培养基稀释lipofectamine2000(Invitrogen，美国)1 μl，体积为50 μl，室温下静置5 min。每孔用加入20 nmol/L浓度的miRNA 1 μl或miRNA抑制剂和0.5 μg质粒，再加入OPTI-MEM至总体积50 μl，室温下静置5 min，每组数据设置3个复孔。每孔加入100 μl 2.2.5中的转染复合液，晃动24孔板稍加混匀。在5%CO2、37 ℃培养箱中孵育5 h，用新鲜的完全培养基替换含有转染复合物的培养基。
转染48 h后，吸去旧培养基，PBS清洗两次，每孔细胞加入100 μl的PLB(Passive Lysis Buffer)，室温轻微振摇15 min，收集细胞裂解液。将20 μl细胞裂解液加入发光板后，用GloMax生物发光检测仪读取背景值2 s;每样品加入100 μl LAR Ⅱ工作液，快速混匀，读值2 s；读值完毕后，每样品再加入100 μl Stop & Glo ® Reagent，快速混匀后，放入发光检测仪中，读值2 s。
设萤火虫荧光素酶处理后荧光值为Firefly(F)，海肾荧光素酶处理后荧光值为Luciferasi renilla(R)，则活性倍数＝(R/F)样品/(R/F)背景。统计学方法主要采用t检验，P<0.05被认为差异有统计学意义。
对照组中8个SNP的基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(HWpval>0.05)。如表3所示，位于内含子区SNP rs3763040的基因型频率在AI1和对照组之间差异存在统计学意义(P＝0.023)，位于3′-UTR区rs6508459的基因型频率在AI0和AI1组之间(P＝0.012)、rs1058424的基因型频率在ON0和ON1组(P＝0.013)及病例组和对照组之间(P＝0.047)、位于内含子区rs3763040在AI1组和对照组之间(P＝0.020)、位于启动子区rs151244在ON0和ON1组之间差异有统计学意义(P＝0.024)。关联分析结果提示，位于AQP4基因非编码区的SNP位点与视神经炎及自身免疫性疾病的发生显著相关。
目标SNP等位基因型和基因型频率的关联分析结果
目标SNP等位基因型和基因型频率的关联分析结果
| SNP | P™值 | P™′值 | PON值 | PON′值 | PCR值 | PCR′值 | PAI | PAI′值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| rs6508459 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.271 | 0.610 | 0.584 | 0.210 | 0.101 | 0.203 | 0.315 | 0.147 | 0.174 | |
| 基因型 | 0.547 | 0.579 | 0.768 | 0.452 | 0.279 | 0.441 | 0.214 | 0.012 | 0.349 | |
| rs1058424 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.769 | 0.823 | 0.628 | 0.775 | 0.706 | 0.816 | 0.450 | 0.391 | 0.694 | |
| 基因型 | 0.314 | 0.061 | 0.730 | 0.013 | 0.328 | 0.878 | 0.500 | 0.595 | 0.047 | |
| rs335929 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.777 | 0.760 | 0.780 | 0.214 | 0.307 | 0.352 | 0.555 | 0.489 | 0.680 | |
| 基因型 | 0.940 | 0.264 | 0.958 | 0.132 | 0.227 | 0.329 | 0.601 | 0.628 | 0.661 | |
| rs3763043 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.436 | 0.985 | 0.246 | 0.374 | 0.800 | 0.918 | 0.506 | 0.391 | 0.411 | |
| 基因型 | 0.333 | 0.088 | 0.341 | 0.115 | 0.569 | 0.985 | 0.522 | 0.591 | 0.072 | |
| rs3763040 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.087 | 0.519 | 0.068 | 0.378 | 0.461 | 0.155 | 0.023 | 0.072 | 0.115 | |
| 基因型 | 0.219 | 0.374 | 0.188 | 0.658 | 0.723 | 0.362 | 0.020 | 0.084 | 0.289 | |
| rs162007 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.798 | 0.874 | 0.430 | 0.236 | 0.756 | 0.657 | 0.628 | 0.653 | 0.830 | |
| 基因型 | 0.471 | 0.711 | 0.637 | 0.144 | 0.416 | 0.716 | 0.601 | 0.723 | 0.281 | |
| rs2075575 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.924 | 0.549 | 0.638 | 0.136 | 0.856 | 0.957 | 0.648 | 0.585 | 0.750 | |
| 基因型 | 0.978 | 0.218 | 0.894 | 0.262 | 0.982 | 0.994 | 0.505 | 0.502 | 0.889 | |
| rs151244 | ||||||||||
| 等位基因型 | 0.887 | 0.904 | 0.710 | 0.581 | 0.681 | 0.615 | 0.374 | 0.375 | 0.915 | |
| 基因型 | 0.286 | 0.918 | 0.910 | 0.024 | 0.102 | 0.290 | 0.553 | 0.587 | 0.189 | |
注：P，病例组与对照组进行关联分析得到的P值；P™、PON、PCR、PAI为TM1、ON1、CR1和AI1亚组分别与对照组进行关联分析得到的P值；P™′、PON′、PCR′、PAI′为TM1、ON1、CR1和AI1亚组分别与TM0、ON0、CR0和AI0亚组进行关联分析得到的P值；P<0.05为差异有统计学意义
对TM1亚组和对照组、TM1亚组和TM0亚组、ON1亚组和对照组、ON1亚组和ON0亚组的SNP基因型进行非条件Logistic回归分析。位于AQP4基因3′-UTR区的rs1058424(A/T，50.61%比70.45%, OR＝0.430, 95%CI 0.210～0.880)和rs3763043(C/T，50.00%比68.18%, OR＝0.467, 95%CI 0.231～0.994)基因型可能降低出现长节段脊髓炎的风险；3′-UTR区rs1058424(A/T, 46.72%比66.28%, OR＝0.525，95%CI 0.276～0.999)，rs335929(A/C, 45.08%比58.14%, OR＝0.527, 95%CI 0.281～0.987)和启动子0区rs151244(C/T, 50.82%比69.77%, OR＝0.450, 95%CI 0.230～0.881)的基因型可能降低视神经炎发生的风险。结果提示，位于AQP4基因3′-UTR区和启动子区的SNP位点与视神经炎及长节段脊髓炎的发生相关。
在转染克隆有野生型AQP4基因3′-UTR区序列质粒的实验中，miR-323-3p组的R/F值与空白对照组之间差异有统计学意义(P＝0.026), miR-323-3p组与对照miRNA组的R/F值之间差异有统计学意义(P＝0.001)，而miR-323-3p抑制剂组与对照miRNA抑制剂组以及空白组的R/F值之间差异无统计学意义(P>0.05)。提示miR-323-3p能与AQP4基因3′-UTR结合，从而影响其荧光素酶活性，这证实了miR-323-3p对AQP4基因有调控作用，这一调控作用是通过与AQP4基因3′-UTR区的某一特定位点结合实现的。
在转染克隆有SNP位点变异型AQP4基因3′-UTRmut序列质粒的实验中，miR-323-3p组的R/F值与空白对照组(未加入miR-323-3p)之间差异有统计学意义(P＝0.001)，miR-323-3p组与对照miRNA组的R/F值之间差异有统计学意义(P＝0.009)，而miR-323-3p抑制剂组与对照miRNA抑制剂组以及空白组的R/F值之间差异无统计学意义(P>0.05)。提示miR-323-3p也可结合SNP位点变异型AQP4基因3′-UTRmut区并影响其荧光素酶活性，即SNP位点rs1058424单核苷酸的改变不影响miR-323-3p对AQP4基因的调控。
NMO属于复杂性疾病，病因不清，与遗传及环境因素相关。我们及其他课题组研究表明，HLA基因复合体[8]，AQP4基因[4,5]，IL-17受体基因[9]，CD226基因[10]均为NMO的易感基因。此外，同一基因但不同位点突变参与NMO发病，例如对于HLA基因复合体，亚洲NMO与HLA-DPB1*0501相关[8]，而欧美NMO与HLA-DRB1*03相关。由于NMO存在多种致病基因之间，以及基因与环境之间的复杂相互作用，导致易感基因的确定成为难点。
本研究表明，AQP4基因3′-UTR区SNP可能与NMO多个临床表型存在相关性。目前关于AQP4基因多态性与NMO易感性的研究结论不一致。我们及其他课题组发现AQP4基因启动区以及3′-UTR区均存在易感SNP位点[4,5]，而韩国学者未能证实AQP4基因多态性与NMO发病相关[11]。因此总体认为，AQP4基因编码区多态性不会导致AQP4抗原性改变，但是AQP4基因非编码区SNP可能与NMO发病存在相关性。
本研究表明，miR-323-3p对AQP4基因有调控作用，这一调控作用是通过与AQP4基因3′-UTR区的某一特定位点结合实现的，但该位点并非单一的rs1058424位点。3′-UTR区是多数miRNA的靶标，3′-UTR中的SNP可以与miRNA结合，而SNP位点的改变可影响miRNA对靶基因的作用。因此，miRNA可通过与靶基因mRNA的3′-UTR上的特定区域碱基互补结合，介导mRNA的降解或翻译抑制，从而在转录后水平调控靶基因的表达。通过GenBank网络数据库可以预测AQP4存在多种miRNA，理论上证明miRNA可能对AQP4的转录以及翻译进行快速的调控[12]。最近Sepramaniam等[13]发现，miRNA-320a可以与AQP4基因3′-UTR区结合，抑制AQP4表达，该研究成为3′-UTR区参与AQP4基因转录后调控的有力佐证。最近还有报道，AQP4基因5′-UTR区也对AQP4基因表达具有调控作用。Pisani等[14]报道AQP4基因5′-UTR区可以进行M1/M23转录后调控，从而影响OAP的形成。Sepramaniam等[15]报道，Mir-130a可以直接抑制AQP4-M1启动区的转录活动而调控AQP4表达。由于与基因转录后调控相关的元件多位于mRNA的5′-UTR和3′-UTR区，其中3′-UTR区可影响mRNA的稳定性，转录后修饰，转运与亚细胞定位，以及蛋白质翻译水平调节，在转录和翻译调控中起重要作用。正常组织以及病理情况下(如NMO)，AQP4蛋白OAP结构的表达都可能受到3′-UTR多态性的调控。因此，AQP4基因非编码区可以对AQP4 mRNA的稳定性等进行转录后调控，进而影响AQP4的表达量以及OAP结构形成(M1/M23比例)，最终影响NMO中AQP4的抗原性。
总之，本研究初步表明，AQP4基因3′-UTR区的基因多态性与NMO临床表型具有相关性。miRNA 323-3p可能通过与AQP4基因3′-UTR区某一特定位点结合起调节作用，从而参与NMO发病。未来将进一步研究明确3′-UTR区对AQP4表达表观调控的影响，研究3′-UTR区作为调控AQP4抗原表达的新靶点，为开发作用于AQP4基因3′-UTR区的NMO药物治疗奠定基础。
