胥瑾; 杨应忠; 王展; 汤锋; 嘎琴; 格日力

doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.18.006

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• 临床研究 •

青藏高原藏族高原红细胞增多症与EDNRA基因遗传多态性的关系

中华医学杂志, 2015,95(18) : 1382-1385. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.18.006

摘要

目的

探讨EDNRA基因的遗传多态性是否和青藏高原藏族的高原红细胞增多症(HAPC)易感性有关。

方法

采用病例对照研究策略，研究了63名HAPC藏族和131名健康的、年龄和性别相匹配的对照藏族，所有的藏族都来自中国青海省海拔3 500米以上的玉树地区。采用Sequenom Mass ARRAY的方法检测了所有研究对象EDNRA基因的5个SNP位点(rs10003447, rs1801708, rs2048894, rs5335 and rs6841581)基因型和等位基因分布，比较各SNP位点在两组之间的差异。

结果

发现EDNRA基因的5个SNP位点等位基因在HAPC组和健康对照组的分布差异无统计学意义(P＝0.742；P＝0.733；P＝0.828；P＝0.417; P＝0.096)。

结论

虽然EDNRA基因多态性和藏族适应高原有关但是和藏族HAPC的易感性无关。

引用本文: 胥瑾, 杨应忠, 王展, 等. 青藏高原藏族高原红细胞增多症与EDNRA基因遗传多态性的关系 [J] . 中华医学杂志, 2015, 95(18) : 1382-1385. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.18.006.

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青藏高原是世界上海拔最高的高原，平均海拔在4 000 m以上，大部分的藏族人长期居住在青藏高原海拔3 500 m以上的高原地区^[1]。这些藏族拥有适应低氧环境的独特遗传优势，表现为更低的血红蛋白(Hb)水平，更低的红细胞压积(HCT)，更高的新生儿动脉血氧气饱和度，更强的低氧下劳动耐力^[2]。但是有部分世居藏族表现出高的血红蛋白浓度，甚至发展为高原红细胞增多症(HAPC)^[3]。HAPC的特征是过度的红细胞增生，(男，血红蛋白浓度 ≥210 g/L；女，血红蛋白浓度≥190 g/L)^[4]。久居高原的人群机体为了适应高原低氧，血液循环中增生出更多的红细胞去携带更多的氧气到机体各组织，所以会出现代偿性的红细胞增生现象。过度的红细胞增生就发展为HAPC，HAPC发生在5%～18%的青藏高原居民中^[5]，可以导致机体血液黏度增加，微循环障碍，睡眠呼吸紊乱，血栓及组织器官损伤^[6,7,8]。虽然高原低氧环境被认为是高原居民发生HAPC的使动因素，但HAPC具体的发病机制还不十分清楚。

EDNRA(Endothelin receptors type A)基因被XP-EHH (Cross Population Extended Haplotype Homozogysity)和iHS(integrated haplotype score)方法检测出是和藏族适应高原低氧环境相关的正选基因^[9]。它主要介导EDN1(endothelin 1)的功能，例如启动内皮细胞和血管平滑肌的迁移和增殖，刺激T淋巴细胞的增殖，促进单核/巨噬细胞的趋化作用。EDNRA表达于血管平滑肌，和血管平滑肌的作用有关。它的多态性和很多疾病有关，如冠状动脉疾病、原发性胆汁性肝硬化和囊性纤维化肺疾病等^[10]。很多研究表明EDNRA, EPAS1, EGLN1, PPARA是高原世居藏族适应高原的相关基因^[9,11]。是否所有的藏族都具有相同的EDNRA基因基因型，是否EDNRA基因的多态性和HAPC的易感性相关尚不十分清楚。本研究为了验证EDNRA基因的多态性可能和藏族HAPC易感性有关，检测了青海省玉树地区(海拔3 500 m以上)63个藏族HPAC患者和131个健康藏族EDNRA基因的5个SNP位点(rs10003447, rs1801708, rs2048894, rs5335 and rs6841581)。

对象与方法

一、对象

收集中国青海省西南部玉树地区(平均海拔3 760米)63例HAPC藏族患者(HAPC组)年龄(45.5±10.1)岁，131例健康藏族对照组年龄(45.1±11.8)岁，均为世居康巴藏族。所有的HAPC患者是在2011年5月至2013年6月在玉树州人民医院被诊断为HAPC。纳入标准是：红细胞过度增生(男，血红蛋白≥210 g/L；女，血红蛋白≥190 g/L)。随机选择年龄、性别、工作条件和HAPC组病例一致的在门诊常规体检的健康藏族作为对照组。迈德血液分析仪(BC-2300，深圳，中国)用来检测静脉血的血红蛋白(Hb)和红细胞压积(HCT)，脉搏氧饱和度仪(Ohmeda 3700 Pulse Oximeter, Datex-Ohmeda, Boulder, Colorado，美国)。所有的研究对象都没有呼吸病史和心脏病史，比如慢性阻塞性肺疾病，肺部感染，心脏瓣膜病，先天性心脏病和高血压心脏病。该项研究获得青海大学医学院伦理委员会批准。

二、DNA提取和分型检测

采用Gentra Puregene全血试剂盒(Qiagen, Germany)，按照标准步骤从受试者的静脉血中提取基因组DNA。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20 kb。质检合格的DNA将浓度调整到50 ng/μl，转移至384孔板，–20 ℃储存备用。采用Sequenom MassARRAY^® SNP (博奥生物集团有限公司)分型检测方法，经过多重PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)进行分型检测。将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用特异的延伸引物与PCR产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术，检测延伸产物分子量的大小，通过判断分子量的差异而进行SNP分型检测。使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。

三、统计学分析

采用SPSS 17.0软件处理，χ²检验方法分析EDNRA基因的5个SNP位点的基因型和等位基因频率分布在HAPC组和对照组之间的差异，用比值比(OR)，95%可信区间(95%CI)和P值表示，以P<0.05为差异有统计学意义，Hardy-Weinberg平衡(HWE)是在基因型频率的基础上用χ²检验方法分析出来的。

结果

1．一般表型资料结果：

HAPC患者和对照组的平均年龄，性别，动脉氧饱和度(SaO₂)、血红蛋白(Hb)和血细胞比容(HCT)在表1中列出。HAPC的发病率在男性比女性高，符合已知的HAPC在男性中高发的倾向^[12]。HAPC组的SaO₂显著降低，Hb和HCT显著升高(P<0.05)。

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表1

HAPC　组和对照组的一般表型资料

表1

HAPC　组和对照组的一般表型资料

组别	例数	性别	平均年龄(岁)	SaO₂ (%)	Hb (g/L)	HCT (%)
HAPC组	35	男	47.7±3.4	83.4±1.8^a	230±25^a	66.6±2.9^a
	28	女	42.8±3.6	85.1±1.4^a	201±17^a	59.9±3.8^a
对照组	74	男	46.4±3.5	88.8±1.6	162±31	46.6±3.6
	55	女	43.2±2.9	87.3±1.3	158±24	41.6±2.1

注：SaO₂：动脉氧饱和度，Hb：血红蛋白，HCT：血细胞比容，与对照组比较，^aP<0.05

2．基因型和等位基因的分布结果：

表3结果显示HAPC组和对照组EDNRA基因的5个SNP位点(rs10003447, rs1801708, rs2048894, rs5335 and rs6841581)的基因型和等位基因频率分布。HAPC组和对照组都符合Hardy-Weinberg平衡分布(表2)。我们比较了基因型、等位基因频率分布及比值比(OR)、95%可信区间(95%CI)，发现这5个SNP位点的多态性在HAPC组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

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表2

HAPC　组和对照组Hardy-Weinberg(HWE)平衡分析

表2

HAPC　组和对照组Hardy-Weinberg(HWE)平衡分析

组别	P值	rs10003447	rs1801708	rs2048894	rs5335	rs684158
HAPC组	HWE	0.210	0.353	0.247	0.452	0.522
对照组	HWE	0.224	0.513	0.225	0.844	0.182

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表3

EDNRA　基因的5个多态性位点在HAPC组和对照组基因型和等位基因的频率分布[例(%)]

表3

EDNRA　基因的5个多态性位点在HAPC组和对照组基因型和等位基因的频率分布[例(%)]

多态性位点	基因型和等位基因	HAPC组	对照组	OR(95% CI)	χ²值	P值
rs10003447	CC	36(60.0)	86(66.7)
	CT	23(38.3)	36(27.9)	0.655(0.341～1.258)	1.625	0.202
	TT	1(1.7)	7(5.4)	2.930(0.348～24.685)	1.067	0.302
	C	95(79.2)	208(80.6)
	T	25(20.8)	50(19.4)	0.913(0.533～1.564)	0.109	0.742
rs1801708	AG	26(42.6)	65(50.4)
	AA	12(19.7)	18(14.1)	0.600(0.254～1.419)	1.368	0.242
	GC	23(37.7)	46(35.7)	0.800(0.407～1.573)	0.419	0.518
	G	72(59.0)	157(60.9)
	A	50(41.0)	101(39.1)	0.926(0.597～1.437)	0.117	0.733
rs2048894	CC	36(61.0)	86(66.7)
	CT	22(37.3)	36(27.9)	0.685(0.355～1.322)	1.277	0.258
	TT	1(1.7)	7(5.4)	2.930(0.348～24.685)	1.067	0.302
	C	94(79.7)	208(80.6)
	T	24(20.3)	50(19.4)	0.942(0.546～1.623)	0.047	0.828
rs5335	GG	9(15.0)	28(21.7)
	CC	19(31.7)	38(29.5)	0.643(0.253～1.631)	0.871	0.351
	CG	32(53.3)	63(48.8)	0.633(0.267～1.500)	1.089	0.297
	G	50(41.7)	119(46.1)
	C	70(58.3)	139(53.9)	0.834(0.539～1.293)	0.658	0.417
rs6841581	GG	24(38.7)	64(49.6)
	AA	7(11.3)	7(5.4)	0.375(0.119～1.182)	2.949	0.086
	AG	31(50.0)	58(45.0)	0.702(0.370～1.331)	1.180	0.277
	G	79(63.7)	186(72.1)
	A	45(36.3)	72(27.9)	0.680(0.431～1.072)	2.770	0.096

讨论

内皮素受体A(EDNRA)能够和内源性血管收缩肽内皮素-1结合，从而发挥调节血管舒缩、维持体液平衡等方面的重要作用。ENDNA基因被认为是血管性疾病的易感基因之一^[10,13]。ENDNA基因也被筛选出和藏族对高原环境适应相关^[9]。HAPC的藏族红细胞显著升高的症状是他们不能适应高原环境的一种表现，本研究假设HAPC藏族和健康藏族的高原适应相关基因EDNRA可能存在不同的基因型。所以我们在青海玉树地区海拔(3 500米以上)地区采集了明确临床诊断的藏族HAPC病例和同海拔健康藏族对照的外周血白细胞DNA，检测了两组研究对象的DNA序列中缺氧相关基因EDNRA的5个SNP位点的多态性，通过统计学分析(比较基因型和等位基因分布的两组差异)发现，这5个SNP位点的多态性在HAPC组和对照组之间没有显著性差异(P>0.05)。提示我们：EDNRA基因虽然和藏族多高原环境的适应有关，但是并不能保护他们不罹患HAPC，其多态性和藏族HAPC易感性无关。在北美的高原世居民族安第斯人和藏族生活环境相似，也是高原世居民族，已证实EDNRA基因的SNP位点和安第斯人的新生儿的体重、氧传递显著相关^[14]。但是安第斯人和藏族对高原环境的适应模式有所不同，所以安第斯人群EDNRA基因的研究结果并不能给我们提供很多提示。

我们需要根据国际和国内的研究结果来调整研究藏族HAPC遗传机制的研究策略，重点关注高原缺氧导致的相关基因表达调控变化^[15]，检测更多的藏族适应高原相关基因如EPAS1、EGLN1等的遗传多态性，并将研究热点聚集到表观遗传学、mcroRNA等方面，从而更加系统地研究藏族HAPC的发病机制。

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贡献者信息

胥瑾

810001　西宁，青海大学医学院高原医学研究中心

杨应忠

810001　西宁，青海大学医学院高原医学研究中心

王展

青海大学附属医院肝胆外科

汤锋

810001　西宁，青海大学医学院高原医学研究中心

嘎琴

810001　西宁，青海大学医学院高原医学研究中心

格日力

810001　西宁，青海大学医学院高原医学研究中心

通信作者

格日力

810001　西宁，青海大学医学院高原医学研究中心

Email：geriligao@hotmail.com

关键词

藏族; 高原红细胞增多症; 遗传多态性; EDNRA基因;

基金项目

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目（2012CB518200）

国家国际科技合作项目（2011DFA32720）

国家自然科学基金（31160219）

历史

出版日期：2015-05-12

收稿日期：2014-12-11

本文编辑

陈新石

Clinical Research Articles

Association between genetic polymorphisms of EDNRA gene and high altitude polycythemia in Tibetans at the Qinghai-Tibetan Plateau

Jin Xu, Yingzhong Yang, Zhan Wang, Feng Tang, Qin Ga, Rili Ge

Published 2015-05-12

Cite as Natl Med J China, 2015, 95(18): 1382-1385. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.18.006

Abstract

Objective

To test the hypothesis that the polymorphisms in EDNRA gene are associated with the susceptibility to high-altitude polycythemia (HAPC) in Tibetans at the Qinghai-Tibetan Plateau in China.

Methods

We enrolled 63 Tibetan HAPC patients and 131 healthy, age-and gender-matched control Tibetans. All subjects came from Yushu area of Qinghai where the altitude was over 3 500 meters. Five SNPs of EDNRA gene (rs10003447, rs1801708, rs2048894, rs5335 and rs6841581) were genotyped by the Sequenom MassARRAY SNP assays.

Results

None of five SNPs in EDNRA gene were associated with HAPC risk (P=0.742; P=0.733; P=0.828; P=0.417; P=0.096).

Conclusion

EDNRA gene is likely to have adaptive benefits for high altitude environment. However, it is not protective against HAPC in Tibetans.

Key words:

Tibetans; High altitude polycythemia; Polymorphism; EDNRA gene

Contributor Information

Jin Xu

Research Center for High Altitude Medical Sciences, Qinghai University School of Medicine, Department of Clinical Medicine, Qinghai University School of Medicine, Xining 810001, China

Yingzhong Yang

Zhan Wang

Feng Tang

Qin Ga

Rili Ge

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