对1例遗传性凝血因子(FⅦ)缺乏症患者进行F7基因分析，初步探讨其发病机制。
用DNA直接测序法分析患者F7基因的启动子、外显子及侧翼、3'非翻译区以及内含子7的重复序列突变位点区域，用反向测序证实所发生的突变。查找数据库和当地150名健康对照者相应序列，确定是否为常见SNP位点。
Sanger测序发现该患者F7基因内含子6发生g.15975 G>A杂合突变(IVS6–1 G>A)，内含子7发生g.16813 A>G多态性突变(IVS7＋7 A>G)。15975位核苷酸发生G>A突变后，内含子5的3'端剪接受体位点不能被识别，最近的候选剪接受体位点位于下游的132 bp处，由此推测IVS6–1G>A突变后，导致外显子6丢失，从而影响FⅦ蛋白的合成分泌及功能。IVS7＋7 A>G多态性突变不引起剪接位点变化，文献报道其会影响蛋白之间相互作用，降低血浆FⅦ活性。
F7基因的IVS6–1G>A杂合突变复合IVS7＋7 A>G突变是导致该患者凝血因子Ⅶ下降的原因。
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遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺乏症是由于凝血因子Ⅶ功能缺陷，影响外源性凝血途径的起始阶段而导致临床出血症状的疾病，由Alexander等[1]于1951年首次报道，发病率为1∶300 000～500 000[2]。在对228例遗传性凝血因子缺乏的患者调查中发现，临床症状绝大多数表现为各种异常出血现象，但出血程度差异较大[3]。该病是一种常染色体隐性遗传病，主要是由F7基因突变所致，目前已发现280多种F7基因突变位点，70%～80%主要是错义突变，其次为剪接位点，超过50%的突变发生在编码催化区的外显子8上。
患者女，23岁，因孕39周见红伴不规律宫缩、瘢痕子宫，拟行剖宫产，在当地医院行术前检查时发现凝血功能异常，凝血酶原时间延长为41.4 s，转入我院。复查凝血功能，凝血酶原时间测定34.9 s、活化部分凝血酶原时间为37 s、Ⅶ因子活性22%，余凝血指标均正常，诊断其为遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症。患者平时牙龈出血，下肢常见皮肤瘀点、瘀斑等，月经量正常，无肝炎、结核、肾炎等疾病，无抗凝药物摄入史，无误服鼠药史，无输血史。2009年剖宫产，手术顺利，凝血功能不详，未输血。父母健在，均体健，非近亲结婚，母亲偶有牙龈出血，下肢常见瘀点、瘀斑。急诊在全麻下行子宫下段剖宫产术，手术经过顺利，新生儿术中出血600 ml，给予注红细胞300 ml，血浆440 ml。术后给予抗感染、补液。当日给予人凝血酶原复合物(华兰生物)及重组人凝血因子Ⅶa，术后出血不多，术后6 d出院。
孕妇签署之情同意书，按Purification Kit试剂盒说明书提取DNA，将提取的基因组DNA用紫外分光光度仪测定样本纯度和浓度，A260/280为1.8～2.0，A260/230>2.0，–20 ℃分装冻存。检测前放置在冰上静置解冻，混合均匀后进行后续实验。选取我院体检健康者150名作为健康对照组，其中男80名，女70名，平均年龄32岁，排除肝肾、血液系统疾病。
用于PCR扩增的FⅦ基因片段的引物序列(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)及条件见表1。25 μl的PCR反应体系：美国KAPA公司2×KAPA2G Robust HotStart ReadyMix 12.5 μl，DNA模板1.25 μl，1对引物各1.25 μl，其他蒸馏水补齐。扩增条件为95℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56～62 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72 ℃持10 min。PCR扩增产物进行双向测序，利用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的F7基因序列(GenBank NG.009262.1)进行比对，寻找基因突变。发现基因突变的序列反向测序予以证实。
引物序列及其PCR反应条件
引物序列及其PCR反应条件
| 外显子 | 引物序列(5'→3') | 扩增长度(bp) |
|---|---|---|
| 5'U | F：AGGCTCTTCAAATATTTACATCR：CGGGCTGGCTCCTGGATTT | 571 |
| 1a | F：GCATGATTGCTATGGGACAAR：CTGCCCTTCCACCAAGTTTA | 491 |
| 1b | F：GTGGGCTGTGAGGGACAGTR：GCAGGGAACACCCTCCTT | 282 |
| 2 | F：GTGGGCCGTGGGGCGGTCTCR：GCCCCACGCGGCCTGGTTCA | 302 |
| 3＋4 | F：TGGTGTGTCCAGTGCTTACCR：CAATTTCCAACTGGGCTGAG | 425 |
| 5 | F：CTTCCAGGCAGAACACCACTR：ATCCCACCTCACAATTGGTC | 388 |
| 6 | F：CTCAGAGGATGGGTGTTTCTGR：TGCTAGGTGTGCTGACTTGG | 330 |
| 7 | F：CAAAGACCCCAGGATTTCAGR：TGAGACACTTGAGAGCTGCG | 482 |
| 8a | F：CTTGCCCCAGAAGGAGACTR：TCTCCCACCTTCCGTGACT | 452 |
| 8b | F：CTGGAGCTCATGGTCCTCAR：TGCCCTCCTCTACCCCATTA | 441 |
| 3'U | F：5'AAGCTCATGCGCTCAGAGCC3'R：5'CCTGGGAGCTACAGCCTCAA3' | 1 296 |
注：F为上游引物，R为下游引物
针对此孕妇的突变位点，筛查dbSNP基因数据库中的常见SNP位点和千人基因组数据库中出现过的突变位点，比对当地150名健康体检者DNA，PCR扩增相应突变位点并测序。非多态位点的内含子突变用剪接位点预测软件(URL address: http//www.fruitfly.org/seq_tools/ splice. html)，通过剪接位点积分(splice site score，SSS)，预测剪接位点改变对剪接方式的影响，并对正常的F7基因5号到7号的内含子3'、5'端剪接位点进行SSS分析。
参照GenBank NG.009262.1设计扩增内含子7重复序列的引物F：5'AATGTGACTTCCACACCTCC 3'，R：5'GATGTCTGTCTGTCTGTGGA 3'，25 μl的PCR反应体系包括：美国KAPA公司2X KAPA2G Robust HotStart ReadyMix 12.5 μl，DNA模板1.2 μl，1对引物各1.30 μl，其他蒸馏水补齐。扩增测序反应同上，得到序列峰图后利用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的F7基因序列(GenBank NG.009262.1)进行比对，参照文献所提供的重复单元类型如表2，鉴定该患者IVS7的重复序列串联组成。
IVS7 短串联重复序列
IVS7 短串联重复序列
| 单元名称 | 序列 | ||
|---|---|---|---|
| M1 | CGCGGTGCTGGTCCGAC | GGTGGGTACC | ACTCTCCCCT |
| M2 | CGCGGTGCTGGTCCGAC | GGTGGGTGCC | ACTCTTCCCT |
| M3 | CGCGGTGCTGGTCCGAC | GGTGGGTGCC | ACTCTCCCCT |
| M4 | CGCGGTGCTGGTCCAAC | GGTGGGTGCC | ACTCTCCCCT |
| M5 | CGCGGTGCTGGTCCGAC | GGTGGGTACC | ACTCTCCGCT |
| M6 | CGCGGTGCTGGTCTGAC | GGTGGGTACC | ACTCTCCCCT |
通过对先证者F7基因的所有外显子、其侧翼测序，以NCBI基因库(GenBank)公布的F7序列NG.009262.1为对照，发现IVS6–1G>A杂合复合突变及IVS7＋7 A>G突变(图1，图2)。通过查对dbSNP基因数据库、千人基因组数据库中的多态位点以及对150名当地健康人进行筛选时均未发现IVS6–1G>A。通过剪接分析软件分析正常人内含子5的3'端剪接位点积分为0.86，而该例患者内含子5的3'端剪接位点消失，选择最近的候选的剪接位点(剪接位点积分：0.76)位于下游的132 bp处。其他相关内含子的剪接位点积分未发生改变。推测该突变致外显子6缺失。而IVS7＋7 A>G为多态性位点(dsSNP数据库中已有报道，多态序列为rs519650)，其在人群中的杂合率为0.010，根据文献报道此位点突变会引起FⅦ活性下降。
该患者IVS7等位基因为H6(133356)/H6(133356)，该类型在人群中发生频率较低，其对血浆FⅦ活性水平影响尚无相关报道。
FⅦ是由肝脏合成分泌的一种依赖维生素K的糖链蛋白，以无活性的酶原形式分泌入血液，血管损伤后释放的组织因子(TF)可快速激活FⅦ，使之成为活化FⅦa。FⅦa与TF一起激活凝血因子Ⅸ和Ⅹ，参与外源性凝血途径的启动和凝血过程。FⅦ分为4个不同的结构区域：r–羧基谷氨酸(Gla)区、2个表皮生长因子样区(EGF)和催化区。催化区包括激活区和蛋白酶区，激活区是FⅦ被激活为FⅦa的部位，而蛋白酶区是识别并裂解底物(FⅠⅩ、FⅩ、FⅦ)的部位，催化区的组氨酸–193、天门冬氨酸–242和丝氨酸–344组成丝氨酸蛋白酶所特有酶活性中心，是维护FⅦ结构和功能的重要部分。
编码FⅦ因子的F7基因定位于13q34，含9个外显子(1a、1b～8)和8个内含子，外显子2编码Gla区，外显子3编码1个小的疏水区，4、5号外显子编码EGF区，6～8号外显子编码催化区。据人类基因突变数据库Human Gene Mutation Database(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php？gene＝F7)最新统计已发现F7基因突变有280多种，包括错义、无义、剪切位点、启动子、小的插入和缺失等6种突变。其中错义突变最多，其次为剪接位点及缺失突变。在F7基因编码的4种不同的结构区域中均发现了突变，但以功能区突变数量最多，其中以偏码催化区的外显子8为主。另外，目前还发现影响血浆FⅦ水平的多种基因多态性，如F7 IVS7、R353Q等[4,5]，这些多态性通过影响FⅦ分泌、降低转录效率等影响血浆FⅦ水平，从而加剧FⅦ缺陷症临床表型的多样性。
本例凝血因子Ⅶ缺乏的患者因在当地孕期检查发现凝血功能异常来院就诊，经本院凝血功能反复检测发现该患者凝血酶原时间延长，活化部分凝血酶原时间正常，凝血因子Ⅶ活性减低，基因检测发现IVS 6–1G>A杂合突变及复合IVS 7＋7A>G突变。应用剪接分析软件分析其IVS6–1G>A杂合性突变对F7基因的影响，发现其破坏了经典的GT–AG规则中剪接受体位点的保守序列，使内含子5不能被正常剪接，当15975位核苷酸发生G→A后，内含子5的3'端剪接受体位点不能被识别，最近的候选的剪接受体位点位于下游的132 bp处，由此推测15975G→A突变后，导致外显子6丢失，从而影响FⅦ蛋白的合成分泌及功能。2009年Yu等[6]首次报道该突变位点并应用体外表达及异位表达技术研究了该剪接突变致FⅦ缺乏的机制，1例F7基因(NM_000131.3) c．572–1 G>A和F7基因(NM_000131.3) c．1165T>G复合杂合突变的患者，体外表达发现异常剪接，丢失了外显子6，与剪接软件预测一致，外显子6丢失后产生1个缺失110 bp的异常mRNA，而且在Thr130后53个氨基酸残基处提前终止。外显子6的丢失、异常mRNA都会影响FⅦ因子的合成和功能。
在已报道的3个无亲缘关系的F7基因发生IVS6–1G>A突变的汉族家系[6,7,8,9]中，先证者皆是15975 G→A复合其他突变点，临床表现明显而在家系调查中仅携带15975 G→A杂合突变的患者无出血的临床表现，其各项凝血指标均在正常范围。不排除基因表达的临床表现的异质性即相同突变患者临床表现有差异，轻重各异。金艳慧等[10]报道的His348Gln纯合突变的先证者，其临床表型为轻型和无症状，但Wulff和Herrmann[11]研究His348Gln纯合突变患者表现为重型FⅦ缺陷症，说明FⅦ缺陷症的基因突变与临床表型无明显相关性。
有研究发现F7基因多态性对血浆FⅦa水平影响约为30%～63%，其中1项对双胞胎的研究表明，57%的血浆FⅦ变化是受基因多态性的影响[12]。定量分析显示位于第7内含子区域的等位基因的高度重复序列是一个功能性多态性，与较低mRNA表达相关，此发现IVS7重复序列可影响基因表达的不同步骤，每个重复的G三联体，也可作为内含子拼接的增强序列，G三联体量的提高可提高拼接因子的结合，以此解释重复序列与mRNA表达的正相关[5,13]。故在筛查F7基因的启动子区、所有外显子及3'非翻译区的基础上，需对F7基因IVS7多态性进行分析。内含子7发生g.16813 A>G多态性突变(IVS7＋7 A>G)即IVS7＋7G已有文献报道此位点虽然并不影响拼接中心序列及GGG部位，但可调节剪接过程不同分子间的相互作用，可导致FⅦ活性的变异。Pinotti等[14]认为该位点为无功效的多态性位点，但后来发现与对照组相比7G组患者血浆FⅦ活性水平降低23%，利用minigene方法研究7G的mRNA表达的影响，发现7G与IVS7短串联重复序列H5、H6、H7、H8相比其mRNA表达量最低[5]。F7基因的IVS6–1G>A杂合突变复合IVS7＋7 A>G是首次报道的复合突变，推测其应为导致该患者凝血因子Ⅶ下降的原因。
大多数的IVS7多态性的研究都只是研究重复序列不同拷贝数与临床的关系，而对于重复单元的差异关注较少。按照串联顺序将单位编码为M1、M2、M3、M4、M5、M6，M4出现的频率较低，多由M3替代，常见的类型为H6(123356)和H7(1333356)，患者IVS7等位基因为H6(133356)/H6(133356)，等位基因H6(133356)携带率仅为0.006，Giansily–Blaizot等[13]的2例患者均为F7 H6(133356)/H7(1333356)复合其他位点突变，患者血浆FⅦ活性较低(分别为14.5%和2%)，但无明确报道该等位基因型对血浆FⅦ活性水平的影响，有待进一步研究。
