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精原干细胞(spermatogonial stem cell, SSC)是精子发生的基础，历经SSC的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段形成成熟精子，是男性将其遗传物质传递给子代唯一的成体干细胞[1]。人精原干细胞(human spermatogonial stem cell, hSSC)位于生精小管基底膜处，是由原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)发育分化而来。人类精子发生始于青春期左右，1个hSSC经过8～9次有丝分裂和2次减数分裂大约生成128个精子，每个完整的生精周期持续70 d左右。hSSC一方面通过自我更新来维持其数量的相对稳定，另一方面可增殖分化为各级生精细胞并最终形成精子，正常情况下hSSC通过复杂、精细的调节达到两者间的相对平衡。此外，最近研究认为hSSC在体外培养条件下可发生转分化进而获得多能性，显示了其在再生医学领域广阔的应用前景[2]。因此，对hSSC的特征表型、分离富集和体外培养(包括长期培养和诱导分化等)进行研究，有助于我们更好地认识hSSC生物学特性、揭示男性生育过程，并为其在生殖医学和再生医学领域的应用奠定基础。
研究hSSC的特征表型有助于我们鉴定和分离hSSC，是hSSC相关研究的基础。目前研究已发现许多动物SSC的特征表型，但在hSSC特征表型方面的研究进展则相对缓慢，而人和动物SSC的特征表型不尽相同，尽管一些特异标志物为hSSC和啮齿类动物SSC所共有，但部分啮齿类动物SSC的特异标志物在hSSC并不表达，因此对hSSC的特征表型进行研究十分必要[3,4]。
目前已发现的且较为公认的hSSC特征表型有CD9、GPR125、GFRA1、THY-1(CD90)、ITGA6(CD49f)、RET、PLZF、UCHL1、LIN28和SSEA-4等[3,5,6,7,8]。鉴于人类睾丸细胞类型的复杂性，在确认某一标志物是否为hSSC的特异标志物时，有必要选用尽可能多的、公认的hSSC特异标志物对其加以验证。此外，目前公认的鉴定SSC的金标准是将其进行移植，若其能重塑精子发生过程则移植细胞可被证实为SSC，因此在验证某一标志物是否为hSSC的特征表型时，当前最公认的方法便是对该标志物阳性的细胞进行移植以明确其生物学功能，这是此类研究的难点，也是目前许多相关研究所欠缺的。
hSSC的分离富集是hSSC研究与应用的基础。目前，分离富集hSSC的方法主要有差异贴壁法、密度梯度法、干细胞克隆挑选法、流式细胞术分选法(fluorescence-activated cell sorting, FACS)和免疫磁珠细胞分选法(magnetic-activated cell sorting, MACS)等。
差异贴壁法主要是根据不同类型的睾丸细胞对某一介质的贴壁能力不同来分选目的细胞。在未经包被的培养皿中，以支持细胞为主的睾丸体细胞贴壁能力远大于生精细胞。鉴于此，Yang等[9]分离了生精功能阻滞于精原细胞阶段的隐睾后非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia, NOA)患者的生精细胞，通过差异贴壁法去除睾丸体细胞，剩余细胞经验证主要为SSC。SSC主要位于生精小管基底膜处，而层黏连蛋白(laminin)是基底膜处细胞外基质的主要成分之一，将生精细胞接种于laminin预包被的培养皿中，SSC可优先、特异地黏附其上，并易形成细胞克隆，因此可利用laminin来分选SSC，此法属于差异贴壁法的一种，也有人称之为基质选择法(matrix selection)[10]。目前利用laminin进行SSC分选的研究主要集中在动物方面，在hSSC分选方面多是与其他分选方法的联合应用，尚未见单一应用laminin分选hSSC的研究。差异贴壁法纯化hSSC操作简单，费用成本低，但需要细心观察细胞的贴壁情况，要求具有丰富的经验。
由于不同类型生精细胞的大小和重力等各不相同，其在不同密度梯度的分离介质(如Percoll液和牛血清白蛋白)中可沉降于不同层面，将富含hSSC的层面进行收集即可实现hSSC的富集。Liu等[11]通过Percoll密度梯度离心法收集了27%～35%Percoll液层面的细胞，继而用差异贴壁法进一步去除混杂的体细胞，获得了纯度达86.7%的hSSC。相对于Percoll密度梯度离心法所用介质形成的是不连续的密度梯度，STA-PUT重力沉降法形成的则是连续密度梯度，可更高纯度的分选目的细胞，Liu等[12]首次利用这一方法分选了hSSC，经验证其纯度可达90%，但由于部分次级精母细胞的大小和重力与hSSC十分接近，因此分选的hSSC可能混有部分次级精母细胞。
由于干细胞具有形成细胞克隆的特性，而分化的细胞无此功能，因此人睾丸生精细胞中可在体外培养条件下形成克隆的细胞即可视为hSSC。Lee等[13]分离了NOA患者的睾丸细胞，在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)等因子作用下，部分生精细胞形成了细胞克隆，挑选部分克隆进行传代培养后，经鉴定这些克隆细胞为生殖干细胞样细胞(germ stem cell-like cell, GSC-LC)，而成年男性的GSC-LC可被视为SSC。Mirzapour等[14]采用类似方法对NOA患者的部分生精细胞所形成的细胞克隆进行挑选，并将这些克隆细胞移植到裸鼠睾丸内，从生物功能学上证实了其为SSC。Sadri-Ardekani等[15,16]联合应用差异贴壁法和干细胞克隆挑选法对青春期前和成年男性的SSC进行分离富集，选用改良式StemPro-34培养基对其进行培养，对形成的细胞克隆进行传代，并通过细胞异种移植实验证实了分选的细胞为SSC。Koruji等[17]采用相似的方法纯化了NOA患者的SSC，并从亚细胞结构水平证实了分选的细胞为SSC。由于hSSC在体外培养时可自发分化为胚胎干细胞样细胞，因此在采用干细胞克隆挑选法分选hSSC时要对可能存在的胚胎干细胞样细胞进行鉴别，以保证分选的hSSC的纯度[18]。
FACS和MACS分选hSSC主要依赖于hSSC的特征表型，其分选效率与所选抗体的特异性密切相关。目前已应用于FACS分选hSSC的标志物有CD49f[19]，应用于MACS分选hSSC的标志物有GPR125、GFRA1、CD9、CD49f和SSEA-4等[3,6,8,20,21]。应用这两种方法分选获得的hSSC纯度可达到90%～95%。相对于FACS，MACS分选hSSC操作更简便，且对起始细胞数量要求较低，因此更适宜于hSSC的分选。
目前在对hSSC进行分离富集时，常常采用两种甚至两种以上分选方法的联合应用，如差异贴壁法联合MACS，这样可获取更高纯度的hSSC，更大程度降低单一分选方法所存在的不足。
获得足够数量的hSSC是对其进行研究与应用的基础，但由于hSSC的数量很少，仅占全部生精细胞的0.03%～0.05%[22]，因此建立稳定的hSSC体外培养体系并实现其扩增具有重要意义。在体内，hSSC依赖其所处的复杂、精细的微环境来实现自我更新与分化的相对平衡，这一微环境主要由以支持细胞为主的体细胞及其分泌的多种因子构成。为了实现hSSC的体外培养与扩增，体外培养条件需最大程度地模拟其在体内的微环境，特别是要包含一些关键因子。
目前在对hSSC进行体外培养与扩增时最常选用的培养基是StemPro培养基，并在此基础上添加胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、bFGF和LIF等，这些因子在维持hSSC自我更新方面发挥着不可或缺的作用[23,24]。He等[3]在StemPro培养基基础上添加上述因子和Nodal、β转化生长因子等，对MACS分选的GPR125＋hSSC培养14 d后，发现hSSC数量增加了5倍以上。Sadri-Ardekani等[15]联合使用差异贴壁法和干细胞克隆挑选法分离了成人SSC，将其接种于laminin预包被的培养皿中，使用包含有上述关键因子的改良式StemPro-34培养基对其进行了长达28周的体外培养，细胞数量扩增了18 450倍，将长期培养获得的细胞移植到免疫缺陷小鼠睾丸内证实其生物学功能，发现体外长期培养后获得的细胞仍为hSSC。此后，其利用同样的方法对青春期前男性的SSC进行体外培养扩增，获得了类似的结果，进一步证实了这一方法的可行性[16]。Lim等[20]在StemPro-34培养基基础上添加上述因子，将MACS分选的CD9＋hSSC培养在laminin预包被的培养皿中，发现这些细胞可在体外生长6个月以上并维持hSSC的特性。Conrad等[25]采用MACS和laminin基质选择法分选了成人SSC，采用在StemPro培养基基础上改良的人生殖干细胞培养基，实现了长达14个月的hSSC长期培养。
除了StemPro培养基外，一些研究还尝试使用其他类型的培养基对hSSC进行体外培养扩增。Chen等[21]利用MACS分选CD49f＋hSSC，并选用人胚胎干细胞来源的成纤维样细胞作饲养层细胞，在DMEM培养基基础上添加GDNF、bFGF和LIF等因子，hSSC可在体外培养达1个月以上且保持hSSC的特性。Mirzapour等[14]在DMEM培养基基础上添加bFGF和LIF等因子，对采用干细胞克隆挑选法分选的hSSC与支持细胞共培养达1个月以上，通过细胞异种移植实验证实了培养后的hSSC仍然维持着其特性。
男性不育已成为影响男性生殖健康的世界性问题，其中NOA约占男性不育症的10%～15%，占无精子症的60%[26]。多数NOA患者都有hSSC存在，但由于机体的生精微环境出现异常导致精子发生难以进行，而SSC作为精子发生的基础，可分化形成精子，将hSSC体外诱导分化为有功能的配子并结合辅助生殖技术(assisted reproductive technique , ART)使其生育自己的遗传学子代具有重要意义。目前对动物SSC进行诱导分化的研究已取得巨大进步，可将小鼠的SSC诱导为精子并获得其子代[27]。最近，一些研究开始尝试将hSSC向精子方向进行诱导分化，并取得了一定进展，但相关研究还很少，鉴于一些诱导人精母细胞、精子细胞或睾丸混合细胞分化的研究对hSSC的诱导分化也有一定的借鉴意义，本文将对此类研究一并作一综述。
最近一些研究表明，SSC进入减数分裂极为重要的条件就是生精小管提供的合适的生精微环境[13]，一些细胞因子和激素等调节物对促进生精细胞分化具有重要作用。目前常用于人类生精细胞诱导分化的细胞因子和激素包括视黄酸、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)、维生素C、维生素E、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和睾酮等。SCF通过SCF/KIT通路在精原细胞分化和减数分裂启动方面发挥着重要作用[28]。维甲酸可通过上调Stra8基因表达诱导未分化的精原细胞转化为分化的精原细胞，并通过激活SCF/KIT通路调节减数分裂[29]。BMP4对SSC的增殖和分化也有明显的促进作用[30]。FSH在维持生精细胞存活和精原细胞增殖方面发挥着决定性的作用，而睾酮在促进精原、精母细胞分化和精子细胞变形过程中起着重要作用。Tesarik等[31,32,33]使用FSH和睾酮对生精阻滞患者的生精细胞进行诱导分化，使其生育了自己的遗传学子代。目前，人类生精细胞诱导分化的方法包括单纯培养法、共培养法和三维(three dimension，3D)培养法。
hSSC单纯培养法指单纯应用能调节hSSC分化的因子和(或)激素等来促使其分化。Lim等[20]将NOA患者的CD9＋SSC用海藻酸钠包被，并添加维甲酸、睾酮、维生素E和FSH等，培养6周后可见部分SSC完成减数分裂并形成圆形精子细胞。Yang等[9]对隐睾后NOA患者的SSC进行体外培养，在维甲酸和SCF共同作用下，部分SSC可进入减数分裂并形成单倍体细胞，通过对诱导形成的圆形精子细胞进行鼠卵异种间注射，证实了诱导形成的单倍体细胞具有受精潜能。
将hSSC与饲养层细胞进行共培养，后者一方面可为hSSC提供物理支持，另一方面还可分泌多种营养成分和因子进而促进hSSC分化。目前对人类生精细胞进行共培养时常选用非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和睾丸支持细胞作饲养层细胞。
Vero细胞可通过分泌生长因子或作为细胞膜受体传递信号来促进生精细胞分化。Cremades等[34]将NOA患者的圆形精子细胞与Vero细胞体外共培养3～5 d后，发现未长鞭毛的圆形精子细胞可分化为长形精子细胞甚至成熟精子。Tanaka等[35]挑选了生精阻滞在初级精母细胞阶段的NOA患者的粗线期精母细胞，将其与Vero细胞共培养，发现与Vero细胞共培养可明显促进其分化为单倍体细胞，并通过鼠卵异种间注射实验证实了诱导生成的单倍体细胞为圆形精子细胞。然而，Vero细胞毕竟是异种细胞，将其应用于临床时必须要考虑其安全性，如潜在的肿瘤发生风险，因此寻找一(数)种可与人类生精细胞进行共培养的人源性饲养层细胞具有重要意义。
睾丸支持细胞是生精微环境中最主要的细胞，其分泌的生长因子如SCF和BMP4等也更适于hSSC的分化培养，同时以自身支持细胞作饲养层对人类生精细胞进行共培养还避免了Vero细胞作为饲养层所存在的不足。Riboldi等[19]利用FACS分选出NOA患者的CD49f＋SSC，将其与患者自身的支持细胞进行共培养，并添加维甲酸、睾酮、FSH和GDNF等，可见部分SSC进入减数分裂，同时还有极少量的单倍体细胞形成。Lee等[13]将NOA患者的SSC与以支持细胞为主的睾丸体细胞进行共培养，并添加维甲酸、睾酮、FSH和维生素E等，诱导培养6周后可见精母细胞和精子细胞形成，同时将圆形精子细胞注射到配偶的成熟卵内，其中部分形成了两原核，遗憾的是其未能获得植入。Sousa等[36]挑选了NOA患者的精原、精母细胞和睾丸支持细胞，并将其组成混合细胞系，在Vero细胞条件培养基基础上添加睾酮和FSH，体外共培养21 d后可见生精细胞重塑了精子发生的大部分阶段，将诱导生成的精子细胞注射到人成熟卵内，发现其具有受精潜能，遗憾的是发育形成的胚胎均表现出性染色体异常，这或许与受精所用的男方配子不甚成熟有关。
相对于传统的二维培养体系，3-D培养可更大程度地模拟机体生精微环境，在体外构建与体内相仿的细胞发育结构系统。动物研究已表明3-D培养有利于生精细胞的体外分化[37]。当支持细胞生长于细胞外基质中时，其分泌的雄激素结合蛋白和转铁蛋白等会显著高于其生长于普通培养皿中，而这些蛋白和因子对生精细胞的增殖和分化发挥着重要作用。目前可用于3-D培养的细胞外基质蛋白包括胶原蛋白、细胞外基质蛋白和层黏连蛋白。为了更好地模拟体内细胞外基质等所形成的生精微环境，Lee等[38]选用胶原蛋白基质对NOA患者的睾丸混合细胞进行3-D培养，同时在维甲酸、睾酮和FSH等作用下进行诱导，发现诱导形成的单倍体精子细胞在所培养细胞中达到11%～37%，显示出3-D培养的优势。
hSSC作为人类精子发生的基础，其相关研究对揭示人类精子发生机制和解决男性不育难题等具有重要意义，在生殖医学和再生医学领域具有广阔的研究与应用前景。尽管关于hSSC的研究才起步不久，目前相关研究却已取得了不少进展，已经发现了hSSC的一些特征表型，并可对其进行分选富集和体外培养扩增，同时将其向精子方向进行分化诱导。然而，目前研究距离阐明hSSC自我更新与分化的调控机制还很远，hSSC体外诱导分化更多是停留在科学研究层次，其临床应用还甚为少见。hSSC不易获得已成为当前相关研究的一大瓶颈，因此亟需实现hSSC的体外高效扩增和(或)稳定的hSSC细胞系的建立，继而为hSSC相关研究提供细胞来源。
