探讨先天性双侧输精管缺如患者囊性纤维化跨膜转导因子(CFTR)基因启动子区域的基因突变情况。
采用PCR技术结合DNA直接测序的方法检测2013年5月至2015年1月于中山大学附属第三医院诊断明确的11例先天性双侧输精管缺如汉族患者及50名健康已生育汉族男性的CFTR基因5'端ATG上游3.8 kb的启动子区域的突变情况，并在NCBI和Cystic Fibrosis Mutation Database在线比对，利用Transfac在线预测及系统发生足迹法联合已经报道的转录因子作用元件，探讨所检测之碱基变异与启动子调控作用的关系。
11例汉族先天性双侧输精管缺如患者中发现c.–8G>C(1例)、c.–966T>G(7例)2个已知CFTR启动子区域的多态性位点及c.–195C>A(1例) 1个单核苷酸位点变异，其中，c.–195C>A位于物种间启动子保守区域。
除外多态性位点，在中国汉族先天性双侧输精管缺如患者CFTR基因启动子区域检测到一个单核苷酸变异，其与疾病发生的关系仍需进一步行生物学实验验证。
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先天性双侧输精管缺如(congenital bilateral absence of vas deference, CBAVD)是男性生殖系统的一种先天性发育缺陷，在男性不育症中占1%～2%，在梗阻性无精子症中占6%[1]。而囊性纤维化跨膜转导因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因突变可引起致死性的囊性纤维化病(cystic fibrosis, CF)，也可合并或单独引起急性反复性胰腺炎、肺部感染、CBAVD[2]。一份荟萃分析显示CBAVD患者的CFTR基因外显子区域突变检出率为78%[3]，目前也认为较常见的外显子区域突变如F508del、G551D等的严重突变导致典型CF病症状；而一些温和突变如R117H等及相对罕见的突变则更多地仅引起CBAVD[4]。国内已开展CBAVD患者CFTR基因全部外显子区域检测[5,6,7]，但涉及调控区域等非编码区突变少见报道，其有无启动子区域突变，是否与CBAVD的发生有关，尚不清楚。因此，本研究利用PCR技术结合DNA直接测序的方法检测11例CBAVD患者(包括1例CBAVD合并马蹄肾的患者)CFTR基因的5'端ATG上游3 956 bp(即转录起始位点上游3 824 bp，Yoshimura等[8]对CFTR第1外显子上游3.8 kb的研究证实CFTR基因核心调控序列位于此区域)的启动子区域基因突变，以初步探究我国CBAVD患者CFTR基因启动子区域的基因突变情况，现报道如下。
选取2013年5月至2015年1月于中山大学附属第三医院诊断明确的汉族CBAVD患者11例及50名有正常生育史的汉族男性。CBAVD患者入选标准：(1)在我院或外院行至少2次精液常规均无精子，精液量少或者正常，精浆果糖及α–糖苷酶为0或者偏低；(2)患者由同一临床医生行阴囊触诊，并经阴囊联合经直肠B超证实双侧输精管缺如；(3)染色体核型为46，XY；(4)性激素水平(卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮)正常；(5)睾丸活检排除生精障碍。本研究通过中山大学附属第三医院临床医学研究伦理审查，所有患者签署临床医学研究知情同意书。
在患者知情同意的情况下采集外周血2 ml，EDTA抗凝，使用DNA抽提试剂盒(QIAGEN KIT)提取DNA；使用Nanodrop紫外分光光度计对DNA样本进行浓度和纯度的检测，要求浓度达到30 ng/μl以上，纯度在吸光度(A)260/280下测得为1.8～2.0之间，–80 ℃保存备用。
从NCBI数据库下载CFTR基因序列，以第1外显子起始密码子AUG为起点向5'端上游3 956 bp的启动子区域序列为参考，应用Primer Premiere 5.0设计PCR引物及测序引物(表1)，并经过NCBI–BLAST检测引物特异性，委托深圳华大基因合成引物。PCR试剂包括Taq酶(PrimeSTAR GXL)、dNTP、缓冲液等购自Takara公司。PCR反应条件：变性94 ℃ 10 s，退火55～58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 45 s～2 min，×30循环，4 ℃保温。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，需目的条带清晰无杂带、浓度>30 ng/μl视为合格样品，委托深圳华大基因公司测序。
引物序列及实验条件
引物序列及实验条件
| 引物 | 引物序列(5'→3') | 退火温度(℃) | 延伸时间 |
|---|---|---|---|
| CFTR启动子PCR引物 | |||
| –361～＋181 bp | 上游：GAGGCTGGGAGTCAGAATCG | 55 | 45 s |
| 下游：CAAAACAATGAATGATAGCGCATC | |||
| –2 638～–241 bp | 上游：ATAAGTCCTCATTCCCACAT | 58 | 2 min |
| 下游：TCTAGCGGCTTTCTCCAC | |||
| –3 956～–2 221 bp | 上游：AGTAACCCCAAGAGAAAACG | 55 | 2 min |
| 下游：GCTTCTAATCAAATCATCCC | |||
| CFTR启动子测序引物 | |||
| –361～＋181 bp | 上游：GAGGCTGGGAGTCAGAATCG | ||
| 下游：CAAAACAATGAATGATAGCGCATC | |||
| –1 486～–241 bp | 上游：ACCTGCTGAACACATTCTT | ||
| 下游：TCTAGCGGCTTTCTCCAC | |||
| –2 638～–1 395 bp | 上游：ATAAGTCCTCATTCCCACAT | ||
| 下游：CTGTATTTGGGTGACCACA | |||
| –3 165～–2 541 bp | 上游：AATGATGCCACAGAAATGGC | ||
| 下游：ATGCTTGCTAACTGTGTTAA | |||
| –3 956～–3 097 bp | 上游：AGTAACCCCAAGAGAAAACG | ||
| 下游：GCATTAGGAAATTCTAT |
注：CFTR：囊性纤维化跨膜转导因子
结合对Chromasome峰图的读图分析，并采用ClustalX软件对测序结果与NCBI下载序列作比对，参考CFTR突变数据库，使用Transfac等在线软件综合分析，观察发现的突变位点与CFTR启动子区域的转录因子结合区域的关系。使用系统发生足迹法，利用DNAman比对：人(Gene ID 1080)、黑猩猩(Gene ID 463674)、长臂猿(Gene ID 100601480)、恒河猴(Gene ID 574346)、牛(Gene ID 281067)、绵羊(Gene ID 443347)、家鼠(Ensembl：ENSMUSG00000041301)、家兔(Genebank accession No. X95931)等8个直系同源物种的CFTR启动子序列(5'端ATG上游3 956 bp)，在不同物种间100%相同的并且连续超过6个碱基的基因序列可被认作为高度保守区域。
患者一般信息及经直肠超声探查精囊发育情况见表2，11例患者中4例伴随双侧精囊腺缺如，4例伴随单侧精囊腺缺如，3例双侧精囊腺存在。通过对测序结果分析，我们在例9中发现1个第1外显子前非翻译区的碱基变异，c.–8G>C；例10中发现1个启动子区域的碱基变异，c.–195C>A；在7例患者包括1例合并肾脏畸形的患者中均有发现1个启动子区域的碱基变异，均为杂合子，c.–966T>G(图1)。行50名健康生育男性的CFTR基因检测对照分析，c.–8G>C频率为0.03(3/100)；c.–966T>G频率为0.60(60/100)；c.–195C>A频率为0，排除c.–195C>A为多态性位点。其中c.–8G>C、c.–966T>G为已经报道的多态性位点(http：//www.genet.sickkids.on.ca/CFTR)。c.–195C>A为美国国立生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)已报道的单核苷酸变异，该位点突变频率为0.000 4。患者一般信息及其对应的基因变异位点见表2。3个碱基变异位点对应的物种保守序列分析见图2。其中c.–195C>A位于1个高度保守序列，5'端ATG上游–205～–195"TTAACCTGGGC"，利用Transfac在线预测该位点可能是潜在的与LF–A1转录因子结合位点：–198～–194"GGGCA"；也可能是与Sp1转录因子结合位点：–198～–193"GGGCAG"。
患者碱基变异情况及经直肠超声探查精囊发育情况
患者碱基变异情况及经直肠超声探查精囊发育情况
| 患者编号 | 年龄(岁) | 输精管缺如类型 | 肾脏畸形 | 碱基变异情况 | 精囊发育 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 左 | 右 | |||||
| 1 | 26 | CBAVD | / | / | – | – |
| 2 | 29 | CBAVD | / | / | – | – |
| 3 | 28 | CBAVD | / | / | – | ＋a |
| 4 | 27 | CBAVD | 马蹄肾 | c.–966T>G (Het) | ＋ | – |
| 5 | 26 | CBAVD | / | c.–966T>G (Het) | – | – |
| 6 | 27 | CBAVD | / | c.–966T>G (Het) | ＋ | ＋ |
| 7 | 29 | CBAVD | / | c.–966T>G (Het) | ＋ | ＋ |
| 8 | 32 | CBAVD | / | c.–966T>G (Het) | ＋ | – |
| 9 | 33 | CBAVD | / | c.–8G>C(Het) | – | – |
| 10 | 33 | CBAVD | / | c.–966T>G(Het)/c．–195C>A(Het) | ＋ | ＋ |
| 11 | 39 | CBAVD | / | c.–966T>G (Het) | ＋ | – |
注：CBAVD：先天性双侧输精管缺如；/：无；Het：杂合子；＋：精囊存在；–：精囊缺如；a精囊发育形态异常
CFTR基因的表达受其自身启动子调控而具有时空性，到目前为止已经有部分CFTR启动子区域调控元件被发现，但其在不同组织和器官中表达调控的分子机制仍然未明[9]。Yoshimura等[8]对CFTR启动子的研究发现，其1号外显子上游长达3.8 kb的序列是其启动子核心区域，但其组织特异性调控序列仍未知。该段序列富含GC(65%)，缺少TATA盒(一般在转录起始位点上游–30 bp处，与TF2转录因子结合启动转录)，存在多个潜在的Sp1及AP–1转录因子结合区域。Boccia等[10]则认为CFTR 5'端区域存在具有调控功能的保守序列，而在这些保守序列发生的碱基变异可能会影响转录因子与启动子序列的结合进而影响(增加或减少)基因的转录活性及(或)转录效率，在不同的组织和器官具有特异性，既可以成为致病因素，也可能成为潜在的治疗靶点。
截至目前为止在CFTR基因突变数据库报道的CFTR突变总共有1 997个(http：//www.genet. sickkids.on.ca/CFTR)，绝大多数为点突变；其中已报道的位于启动子区域的碱基变换有31个，占全部突变的1.55%。本研究在例9中检测到其1号外显子前非翻译区的一个多态性位点c.–8G>C。来自Wu等[6]对36例CBAVD患者的研究中，在1个未检出任何CFTR外显子区域突变的患者中发现携带此位点，该位点是否影响基因的转录活性或效率仍不清楚。本组检测到另外一个多态性位点是c.–966T>G，该位点由Verlingue等[11]最先报道，其对143例CBAVD患者(其中42例携带1个CFTR基因外显子区域突变，101例不携带CFTR基因外显子区域突变)进行CFTR启动子区域的突变检测，只筛查到1个频率为2.2%的多态性位点c.–966T>G，其中CBAVD患者突变频率为0.8%，健康对照组为6%；而我们的研究中发现中国汉族CBAVD患者c.–966T>G的突变频率是0.32(7/22)，正常生育对照组为0.60(60/100)。显然在汉族人群中该位点突变频率较高，这种种族间差异的意义尚待进一步阐明。此外，在1例27岁合并肾脏畸形(马蹄肾)的CBAVD患者，也检测出该多态性位点c.–966T>G，我们前期对其CFTR全部外显子区域进行检测亦未发现任何突变，其病因可能为胚胎时期中肾管发育受损害有关，也可能病变位于其他未知的CFTR调控区域，需要我们扩大检测范围及扩大样本量来验证。通过对物种间保守区域的比对分析可以看到c.–8G>C和c.–966T>G均不位于保守序列区域，Transfac在线预测也没有在这两个区域发现特定的转录因子结合位点。
我们在例10中发现1个已知单核苷酸变异位点：c.–195C>A(–63C>A)，其功能未经验证，此前对该患者CFTR基因外显子区域的基因检测中发现其携带一个外显子区域突变c.1357delT(Het)(p.Leu453Cysfs*16)及13(GT)5T/12(GT)7T多态性，c.–195C>A可能与外显子突变起到一定的协同作用，从而导致CBAVD的发生。c.–195C>A位于一个保守序列区域，–205～–195 bp(5'～3' TTAACCTGGC)，从跨种保留的角度来看，这个区域也极有可能是CFTR基因的调控元件。而通过Transfac在线预测显示该区域可以是LF–A1蛋白的作用结合位点(GGGCA)；也极有可能是一个Sp1结合位点(GGGCAG)[12]。提示在该位点的突变导致与转录因子Sp1结合的启动子序列改变，影响了蛋白–DNA的结合，从而影响了CFTR基因转录活性与转录效率，导致CBAVD的发生。并非所有位于调控区域的碱基变异都引起负性效应。Romey等[13]对1例表现出较轻的疾病体征的CF疾病患者(携带一个严重突变S549R合并–102T>A)进行研究，发现–102T>A突变后的序列可以与YY–1作用元件相结合而诱导CFTR基因的转录，并证实其突变型AA比野生型TT能显著增加CFTR蛋白的表达。而Giordano等[14]对118例CF及CF相关疾病患者进行CFTR启动子区域长达6 000 bp的基因突变筛查，发现23个突变，并对其中17个非多态性位点进行功能验证，得出启动子区域的突变可能对CFTR的转录调控存在不影响、修饰上调或严重致病等几种可能，特别是在38例CBAVD患者中证实c.–674T>C、c.–812T>G、c.–5914A>G 3个具有调控功能的突变位点，揭示了CFTR启动子调控区域的突变导致CBAVD发生的机制。
基因的转录被转录因子结合蛋白所调控，转录因子和它们所对应的结合位点之间的相互作用控制着许多重要的生命进程，例如，对环境压力应答的控制。而研究表明，相关物种基因组的非编码公共保守序列区域富含调控功能元件[15]。因此我们通过比对直系同源物种的CFTR的5'端非编码区域来发现受到进化选择压力而保留的高度保守区域，推测可能的转录因子结合位点。在本研究中，除了2个多态性位点，在保守序列高度集中的启动子区域发现了一个潜在转录因子结合序列的单核苷酸变异c.–195C>A，该位点靠近CFTR5'端核心调控区域，也是多个转录因子结合的区域。说明在高度保守的CFTR启动子调控序列中仍具有一定的基因突变检出率。
综上所述，随着对CBAVD的发病机制的不断研究，CBAVD的发生与CFTR调控区域的基因突变得到关联[16]。而本研究也在国内首次对CBAVD患者中检测出其CFTR基因启动子区域保守序列单核苷酸变异位点：c.–195C>A，其可能通过影响基因的转录调控致病，也可能协同外显子区域突变导致CBAVD的发生。需要我们行后续的功能学实验验证该位点功能。此外，欧美国家研究机构已经将CFTR基因突变检测纳入辅助生殖前遗传诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)[4]，但仅仅针对CFTR基因的热点突变区域或者外显子区域的检测是不够的，还需要对CFTR基因的启动子区域进行基因突变检测。随着我们国家辅助生殖技术的发展，有必要对寻求辅助生殖的CBAVD患者进行常规的CFTR基因外显子区域及启动子区域的基因突变检测，可以避免将潜在的致病基因遗传给下一代，将大大降低CBAVD患者的出生率。
