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心血管疾病(CVD)已经成为人类死亡的主要原因[1]，因此探索可靠的具有高敏感性和特异性的标志物，对于CVD的早期诊断、及时治疗和判断预后具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类保守的内源性非编码单链小分子RNA，它通过特异性结合miRNA的3'端非翻译区在转录后水平调节基因表达[2]。miRNAs能够存在于外周循环中，如血浆等血液成分，而且循环miRNAs能够稳定存在于煮沸、极端pH、室温下的长时间储存和反复冻融等恶劣环境条件中，甚至能够免于内源性核糖核酸酶的降解[3,4]。此外，循环miRNAs符合理想的生物标志物应满足的条件[5]，如具有较高的疾病敏感性和特异性以及能够快速而精确的早期检测等。目前循环miRNAs已在多种肿瘤的早期诊断和预后中显示了独特的价值[4,6]，作为心血管疾病潜在标志物的研究同样已经成为心血管领域的热点，现已发现了各种心血管疾病的特异性循环miRNA谱。本文就miRNAs的基本情况、循环miRNAs与CVD关联研究以及目前存在问题和展望进行综述。
1993年，Lee等[7]在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)体内首次发现miRNA，随后人们对miRNA的结构和功能等进行了大量研究。在细胞核内，miRNA的编码基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录为miRNA的初级转录物(pri-miRNA)；然后，pri-miRNA在核糖核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8/Pasha为核心的多蛋白复合体[8]的作用下，被剪切成具有茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在转运蛋白Exportin5等的作用下被转运至细胞质[9]。在细胞质中，pre-miRNA被双链RNA特异性核酸酶Dicer剪切成21～25 nt的双链miRNA[10]；其后，双链miRNA在特异性解旋酶的作用下解旋，其中一条单链被降解，而另一条单链成为成熟的miRNA。细胞内成熟的miRNAs与靶mRNA上的miRNA依赖性基因沉默复合物(miRISC)结合来发挥调节基因表达的作用[11]。
循环miRNAs具有良好的稳定性，能够抵抗恶劣的外部环境和核糖核酸酶的降解[3,12]，而且容易获得，使得循环miRNAs成为CVD理想的候选标志物。目前研究者们提出了若干循环miRNAs释放和保护的可能机制。
多项研究结果表明，由细胞膜介导的脂质小泡(外来体、微囊泡和凋亡小体等)可能是循环miRNAs释放和保护的可能机制[13,14,15]。除了脂质小泡的形式以外，miRNAs还可与核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)和Argonaute 2等蛋白质结合形成复合物以保护miRNAs在外周循环中不被降解[16,17]。另有研究在人类血浆分离出来的高密度脂蛋白(HDL)中检测到miRNAs[18]；而且家族性高胆固醇血症患者的HDL含有某些miRNAs，所以与脂蛋白结合也可能是循环miRNAs释放和保护的一种机制。此外，Turchinovich等[19]在实验中观察到细胞外miRNA水平随着细胞死亡数量增加而升高，提出了死亡或破裂的细胞可以释放miRNA进入循环的可能性。
综上所述，目前循环miRNAs释放和保护的可能机制包括脂质小泡(外来体、微囊泡和凋亡小体等)以及与特定蛋白质或脂蛋白结合形成复合物。但是，循环miRNAs的释放和保持良好稳定性的具体机制以及只有特定miRNAs进入循环的原因尚不清楚，仍需进一步的探究和阐明。
冠状动脉疾病(Coronary Artery Disease，CAD)以冠状动脉粥样硬化斑块形成为特征，而动脉粥样硬化斑块是导致动脉管腔狭窄的重要原因[20]。参与斑块形成的细胞成分可能会释放miRNAs进入外周循环或从外周循环中摄取miRNAs，从而导致循环miRNAs水平的改变。目前已有研究表明miRNAs参与CAD的发生和发展[21]。因此，循环miRNAs可能是动脉粥样硬化的潜在标志物。
Fichtlscherer等[22]为减少细胞死亡和斑块不稳定对循环miRNAs水平的影响，仅纳入血管造影确诊的稳定型CAD患者作为研究对象，最终发现CAD患者中内皮细胞富含的miR-126、miR-17和miR-92a，平滑肌细胞富含的miR-145，以及炎症细胞富含的miR-155的循环水平均显著降低，而心肌细胞富含的miR-133和miR-208a则显著升高。Wang等[23]同样发现冠心病患者血浆中miR-130a的水平显著高于对照组，而且与冠状动脉狭窄程度呈正相关。此外，Jansen等[24]同样发现，循环微小囊泡中的miR-126和miR-199a水平升高与稳定型冠心病患者心血管病事件发生风险降低有关。另外，Li等[25]在外周动脉疾病患者和对照人群中检测血清miRNAs，发现外周动脉疾病患者中miR-130a、miR-21、miR-27b和miR-210水平均升高，而且miR-130a和miR-27b与疾病严重程度(Fontaine期)有关。由此可见，冠状动脉和外周动脉粥样硬化患者中发生改变的循环miRNAs的种类并不相同，所以这些循环miRNAs可能具有病变位置的特异性。
有研究采用实时PCR来分析CAD患者和健康对照的全血样本，结果显示包括miR-155和miR-145在内的11种循环miRNAs的水平在CAD患者中降低，但是进一步分析发现病例组所服用的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类药物同样会导致其中的7种循环miRNAs(包括miR-155和miR-145)水平显著下降[26]。那么，Fichtlscherer等[22]的研究结果所显示的CAD患者血浆中的miR-155和miR-145水平降低，可能与ACEI类药物有关，因为该研究中83%的CAD患者服用ACEI类药物，而对照组均不服用ACEI类药物。
Sondermeijer等[27]发现，早期CAD患者血小板中的miR-340*和miR-624*含量均较高；而且miR-340*、miR-624*、miR-451和miR-454这4种miRNAs的ROC曲线下面积为0.71，能够鉴别早期CAD患者和对照人群。由此可见，血小板中特异的循环miRNAs具有鉴别CAD患者的潜力，但是仍需进一步的证实。此外，有学者发现，稳定型CAD患者的外周血单个核细胞(PBMC)的miR-146水平上调；随访12个月后，其中13例CAD患者发生了心血管病事件，而且miR-146a是事件的独立预测因子[28]。可见，PBMCs中的miR-146a可能是预测CAD患者发生心血管病事件风险的预后因子。
综上所述，多项研究结果表明在CAD患者不同血液成分中的某些循环miRNAs会发生改变，而且不同血液成分中发生变化的miRNAs并不完全相同，说明CAD患者中的循环miRNAs具有来源特异性。此外，某些循环miRNAs可能有助于CAD的诊断和危险分层；但是，仍需要大样本量的研究来证实。
心肌梗死(MI)是全球人类的主要死因之一，估计每年有超过700万人患有MI[29]。目前心肌肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白T(TnT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心电图被广泛应用于MI的临床诊断，但仍需探索具有更高特异度和灵敏度的诊断指标和预后指标。
miR-208由心肌细胞特异性表达[30]，且正常情况下在外周循环中几乎检测不到。但是，有研究在急性心肌梗死(AMI)的动物模型中发现血浆miR-208的水平在发病后1 h显著升高，在3 h达到峰值，24 h后消失；而在假手术的动物中始终没有检测到miR-208[31,32]。除了AMI动物模型外，研究发现AMI患者的循环miR-208水平显著升高[31,32,33]。然而，有些研究结果显示AMI患者血浆标本中miR-208的浓度很低甚至检测不到，或者仅能在部分AMI患者中检测到[34,35]。这说明，虽然miR-208的心肌特异性表达使其具有较高特异性，但是这同样导致循环miR-208的浓度相对较低，甚至低于检出限，从而使其敏感性降低。此外，miR-208出现峰值较早而且回归到正常水平的时间较短，所以在某些研究中，血标本收集时间较晚也可能是出现矛盾结果的原因[31,35]。除了心肌细胞特异的miR-208外，AMI患者外周循环中来源于肌肉的miR-1、miR-133和miR-499的水平也升高；其中miR-1、miR-133在MI患者中出现症状后2.5 h达到峰值，miR-499在12 h达到峰值而且在48 h仍能被检测到[23,33,34,35,36]。
此外，多项研究在MI患者中进行了心脏特异的miR-208和肌肉中富含的miR-1、miR-133和miR-499诊断能力的研究。Wang等[31]在91%的MI患者中检测到miR-208，而且miR-208鉴别MI患者的能力优于miR-1、miR-133a和miR-499，并与TnI相似，提示miR-208的早期诊断的敏感性较好。有研究证实，MI患者中循环miR-208b和miR-499水平升高，并且与TnT和肌酸磷酸激酶的水平具有相关性，其中miR-499的诊断准确性优于miR-208b，并与TnT相当[37]。此外，Corsten等[33]研究结果显示miR-1和miR-133在AMI患者中仅是中等升高，而miR-208和miR-499的ROC曲线下面积分别为0.94和0.92，具有更好的敏感度和特异度。
目前关于miRNAs与MI预后的研究较少。Widera等[38]通过6个月的随访发现，与稳定型心绞痛患者相比，6个候选miRNAs中只有miR-1、miR-133a和miR-208b在AMI患者中显著升高，其中miR-133a和miR-208b又与死亡风险联系密切。但是，在调整高敏感性TnT后发现，候选miRNAs与MI预后无显著相关性[38]。
除了上述提到的miR-208、miR-133和miR-499等循环miRNA外，有学者发现AMI患者血浆中miR-21-5p和miR-361-5p的水平显著升高，而miR-519e-5p的水平显著降低，而且这3种miRNA均与心肌TnI的浓度有关[39]。另有研究结果显示，AMI患者血浆中miR-328和miR-134的水平显著高于健康人群，而且miRNA的增加程度与心血管死亡风险和心力衰竭的发展呈很强的正相关[40]。
综上所述，多项研究结果表明循环miRNAs可能是MI比较好的诊断和预后指标。某些循环miRNAs(如miR-208和miR-133)的水平改变的较早，有助于MI的早期诊断。因此，将循环miRNAs与传统标志物(如TnI)相结合来更加敏感和特异的诊断MI可能会是未来的发展趋势，但仍需大样本的研究来证实。
心力衰竭(Heart Failure, HF)在成年人中的患病率为1%～2%，其中6%～10%的65岁以上人群患有HF[41]。HF由于其在老年人中患病率高和预后差而成为全球范围内的重大公共卫生问题。因此，探究HF相关的循环标志物对于HF的治疗和判断预后具有重要意义。
有研究发现，急性心衰患者中只有miR-499的水平显著升高，而miR-208b和miR-133水平无明显升高[33]。另有研究结果[42]显示在美国纽约心脏病学会(New York Heart Association，NYHA)心功能Ⅱ级和Ⅲ级患者中没有检测到miR-499水平的变化，呼吸困难的患者和HF患者中的miR-208和miR-1水平同样无明显差异。Tijsen等[43]发现，miR-423-5p的ROC曲线下面积为0.91，能够区分HF和呼吸困难的非HF患者，因此其对于心衰的诊断预测具有较好的敏感度和特异度。此外，有研究[44]结果显示NYHA Ⅲ和Ⅳ级的HF患者中miR-210表达水平显著高于NYHA Ⅱ级HF患者和对照组，因此miR-210有可能成为HF的新标志物。
原发性高血压(简称高血压)是CVD的重要危险因素，所以探索高血压相关的标志物具有重要意义。Li等[45]研究发现，高血压患者的循环hcmv-miR-UL112、let-7e和miR-296-5p水平发生了改变；而于丽萍等[46]同样发现miR-296-5p和miR-133b在高血压患者中表达下调，let-7e和hcmv-miR-UL112水平升高。进一步研究发现，高血压患者体内由人类巨细胞病毒(HCMV)编码的hcmv-miR-UL112水平与高血压患者体内HCMV滴度之间具有高度相关性，而且高血压患者的HCMV滴度要高于对照组[45]。由此可见，HCMV的感染可能与高血压的发病有关。但是，由于血浆中hcmv-miR-UL112水平在高血压患者中具有高度的变异性，所以该循环miRNA能否成为高血压诊断的标志物仍需进一步的研究证实。
随着与CVD相关循环miRNA研究的不断开展，使得人们对CVD的病理生理过程有了更加深入的了解。循环miRNA所具有的良好稳定性、保守性、特异性和容易检测等特征，以及循环miRNA与CAD、MI、HF和高血压等CVD的密切联系，使得循环miRNA有望成为CVD重要的诊断和预后标志物以及治疗靶点。此外，针对丙型肝炎的抗miRNA-122的Ⅱ期临床试验的成功[47]，同样预示着miRNA有潜在可能应用于心血管病的治疗中。但是，与此同时关于循环miRNA与CVD的研究同样面临着挑战。
首先，现有的大部分关于循环miRNA与CVD研究的样本量相对较少，所以需要有大样本量的前瞻性研究来证实循环miRNA对CVD的诊断和预后能力及其能否成CVD的治疗靶点。其次，目前常用的标准化方法包括选取某些miRNA作为内部对照、添加合成的miRNA作为对照以及对血浆容量进行校正等，但是这些方法并不是普遍适用的，所以探索令人满意的循环miRNA测量标准化的方法也是挑战之一。最后，由于疾病发生的原因不同，可能导致不同循环miRNA水平的变化也不尽相同，然而目前大部分研究都是对单个循环miRNA作为CVD潜在标志物进行探索，所以以后的研究应该采用多个循环miRNA相结合来提高对疾病诊断的敏感度和特异度。
综上所述，循环miRNA对于CVD有着广阔的诊断、治疗和预后价值，需要广大的医学工作者不断探索和研究。
