原发性血小板增多症(ET)属于BCR-ABL1基因阴性的骨髓增殖性肿瘤(MPN)，可向真性红细胞增多症(PV)和急性白血病转化。2005年被发现的JAK2基因突变是目前ET的特征性分子标志，其发生率可达50%～60%^[1,2]。而此后被发现的促血小板生成素受体基因MPL W515L/K也在ET中有5%～10%的发生率。尽管如此，仍有近1/3 ET患者并无上述两种基因突变。2013年底，Klampfl等^[3]通过全外显子测序技术，发现了钙网蛋白(calreticulin，CALR)在MPN中尤其是JAK2基因突变阴性的ET中具有较高的发生率且呈现出一定的临床特征，这为我们认识和治疗这一类亚型提供了新的方向^[3,4]。本文就CALR的结构、功能及其与ET间的联系及可能的致病机制做一综述。

CALR基因位于19p13.2，长度为5 891 bp，包含9个外显子。其编码的蛋白有417个氨基酸组成，分为3个主要的结构功能域：氨基端是高度保守的凝集结合结构域，可作为分子伴侣与Zn^2＋结合；中间部分是富含脯氨酸区域，其结合与Ca^2＋和内质网应激蛋白(ERp57)具有高亲合性但容量较低，同时也可作为分子伴侣；羧基端为氨基酸酸性结构域，它包含多个具有低亲和力、高容量的钙结合位点以及内质网KDEL回收信号序列，可调控Ca^2＋缓冲活性。KDEL序列为包含氨赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸等氨基酸的肽链，存在于某些固有内质网蛋白质上，可使这些蛋白质从高尔基体回收到内质网上^[5,6]。

CALR具有多种不同的功能，可存在于内质网内以及内质网外，如细胞表面、细胞质、细胞核和细胞外基质中。在内质网内，该蛋白质主要生理功能是分子伴侣活性及调节维持钙稳态^[7]。它参与蛋白质相互作用及糖蛋白折叠。CALR缺乏可影响蛋白质及糖蛋白的质量，导致错误折叠的蛋白质产生并积累。钙稳态的维持与涉及不同Ca^2＋通道的细胞的生物学过程密切相关。其功能异常可能导致钙稳态的破坏，同时影响一系列Ca^2＋信号传导途径，如心肌发育、脂肪细胞分化和细胞应激等^[8]。

在内质网外，CALR也有不同的生理及病理作用。例如，细胞外基质上的CALR与皮肤伤口的愈合有关，它可增加细胞转化生长因子3的表达^[9]。细胞表面的CALR可增强肿瘤抗原的免疫应答作用，并通过树突细胞的吞噬作用介导免疫细胞凋亡^[10]。而存在于细胞质的CALR功能尚不明确，但有研究发现它参与细胞黏附、翻译、基因表达及核内输出的调节^[11]。

在基因调节方面，Ca^2＋缺乏和细胞应激状态可诱导CALR基因表达^[12]。多种转录因子也参与CALR基因的调节。例如，在新生大鼠心室肌细胞和小鼠成纤维细胞中，CALR基因可由GATA结合蛋白6(GATA6)激活，而被逆转录病毒结合位点1(Evi-1)抑制^[13]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)可通过抑制CCAAT/增强子结合蛋白，从而作为CALR基因表达的负性调控因子^[14]。另外，Ca^2＋浓度也可以影响CALR蛋白的构象，Ca^2＋浓度高于内质网的平均浓度可导致CALR羧基端结构从无序的多肽结构变得更加坚固及紧凑^[15]。

总之，作为存在于内质网内外的多功能蛋白质，CALR与不同的生物学进程有关，包括细胞增殖、凋亡及免疫原性细胞死亡^[16]。

ET是一类分化相对成熟的骨髓细胞克隆性增殖的疾病。这些异常增殖发生在造血干细胞的初期，由于其对正常细胞因子信号通路及基因表达调控的高度敏感性及非依赖性，最终导致细胞过度增殖^[17]。众所周知，JAK2、MPL及淋巴细胞特异性适配器基因(LNK)突变，最终均累及JAK/STAT信号通路，在BCR-ABL基因阴性的MPN中发挥了重要致病作用^[18,19]。然而，无上述突变ET的发病机制尚不明确(尽管一些低频发生的突变如LDH、TET2、ASXL1基因等从表观遗传上进行了一定的解释，但无特异性)。最近通过全外显子组测序技术，在ET中发现了较高频率的CALR基因突变^[3,4]，这一发现为我们进一步认知ET的发病机制提供了十分有用的线索。

ET中CALR基因突变发生在9号外显子，偶有与JAK2及MPL基因突变共存^[3,4,20,21]。在ET中，CALR基因突变总体发生率为15%～30%，但是在JAK2及MPL基因突变阴性的ET患者中，该突变发生率可达50%～70%。而ET患者中JKA2基因突变率约为60%，MPL基因突变率约为5%～10%，约10%的ET患者不伴有上述三种突变^[3,4,22]。CALR基因的突变类型主要为缺失及插入一定数量的碱基对，从而导致阅读框的移位。大多数突变属于Ⅰ型突变(缺失52个碱基对)和Ⅱ型突变(插入5个碱基对，TTGTC)，分别导致del367fs46和ins385fs47；另外，一些复杂突变也可被检测到，如缺失合并插入，最终也导致肽链结构改变^[5,6]。在临床上，与存在JAK2基因突变的ET相比，伴CALR基因突变的ET具有较低水平的血红蛋白(HBG)及白细胞计数(WBC)、较高水平的血小板计数(PLT)，同时存在年龄偏小以及男性较多的现象^[3,4,22]。此外，相对于野生型患者(JAK2、MPL、CALR基因均为阴性)，CALR基因突变的患者主要为男性，并且具有较高水平的PLT ^[22]。多项研究发现伴有CALR基因突变的患者血栓发生率明显低于JAK2突变患者^[3,22,23]。伴有CALR基因突变患者转化为骨髓纤维化的风险高于JAK2突变患者^[6]，但是转化为PV的病例却十分罕见^[23]。有趣的是，虽然伴有CALR基因突变的患者血栓事件发生率较低，但这些患者大多具有较高的PLT(>1 000×10⁹/L)。该现象引起了人们对于PLT在ET患者血管并发症的发病机制中相关作用的思考。似乎粒细胞/血小板的活性及高WBC，与血栓并发症发病机制关系更为密切而非单纯的PLT^[24]。研究发现，CALR基因突变虽然与JAK2、MPL基因突变基本相互排斥，但可以与ASXL1基因共存。ASXL1基因在CALR基因突变的ET中的发生率明显高于JAK2基因突变的ET且ASXL1和CALR基因双重突变ET的HBG明显低于CALR基因单纯突变的ET，提示该类患者的红系抑制更为明显^[21]。

至于CALR基因突变对于疾病预后的影响，可从总生存期(OS)、无血栓生存和白血病进展三方面来看，目前的报道并不一致。Klampfl等^[3]的研究表明，伴有CALR基因突变的患者比JAK2突变患者具有更好的OS，但Nangalia等^[4]和Rotunno等^[22]的研究却发现两者之间没有明显差异。近期Tefferi等^[25]的266例ET长期随访研究结果发现，伴有CALR基因突变的患者与JAK2基因突变患者OS无差异，即使按年龄(≥65岁或<65岁)分开观察也无差异，其白血病进展和骨髓纤维化同JAK2基因突变组比无显著性差异。而Palandri等^[26]在<40岁的217例ET中长期随访发现伴有CALR基因突变的患者比JAK2基因突变患者具有更好的OS及无血栓生存。在无血栓生存方面，研究发现，单因素分析显示，野生型(三重阴性)最长，其次为CALR基因突变者，JAK2基因突变者最短。

既然Ⅰ类突变及Ⅱ类突变在ET患者中最为常见，这两种常见突变类型是否有特异性呢？在ET中，与JAK2基因突变患者相比，Ⅰ类和Ⅱ类突者均表现为低水平的HBG、低WBC和高PLT，而Ⅰ型突变者男性好发，Ⅱ型突变者更为低龄。Ⅰ型突变及Ⅱ型突变之间，Ⅰ型突变PLT明显高于Ⅱ型，而在性别、年龄、WBC、HBG量及国际预后积分危险分层方面均无显著性差异。预后方面，Ⅰ型和Ⅱ型CALR基因突变和JAK2基因突变三者之间在OS上差异无统计学意义，在无血栓生存上亦无明显区别^[27]。总之，CALR基因的不同突变类型可能导致不同的临床表型，我们需要更多的研究来了解这两种主要突变类型对ET的影响。

通过移码突变，CALR基因突变编码的蛋白质损失了C-末端KDEL区域，产生了一种新的多肽序列，使野生型CALR中带负电富含谷氨酸的C末端转变成了带正电富含精氨酸的区域^[28]。理论上，该突变蛋白可影响Ca^2＋的结合和正常细胞的生长。目前CALR基因突变与ET的发病机制尚不清楚。但是，仍有一些研究提供了可能的解释：造血干细胞集落分析已经证实，CALR基因突变发生较早并能保持稳定；通过逆转录病毒并转染Ⅰ型CALR突变的cDNAs到Ba/F3细胞株，Klampfl等^[3]观察到白细胞介素3(IL-3)非依赖性生长及STAT5的活化，表明突变体CALR基因突变可通过STAT通路干扰细胞正常生长。

CALR是钙调磷酸酶的上游调控因子，而钙调磷酸酶的核定位在活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)轴中充当造血祖细胞水平上髓系细胞生长的负性调控因子，在缺乏CALR时，NFAT表达缺失^[29]。另外，体内实验发现，抑制NFAT-钙调磷酸酶可导致巨核细胞生成增加。缺乏CALR，NFAT表达受抑制。因此，CALR基因突变也许可抑制钙调磷酸酶-NFAT信号转导通路，从而有促进粒细胞/巨核细胞系的生长^[30]。此外，已有研究提出：CALR与ERp57一起，抑制STAT3与DNA间的相互作用，从而抑制了STAT3依赖的信号转导途径^[31]。这说明CALR或许可影响ERp57依赖的STAT3的活性。在这项研究中，应用免疫印迹分析表明，STAT3或磷酸化STAT3(Tyr706)水平在crt–/–细胞中没有受到突变体CALR^E239R影响。但是，用荧光素酶报告基因系统定量分析了STAT3活性，表明crt–/–细胞中表达突变体CALR^E239R的STAT3活性明显高于野生型。基于以上证据，推测在ET患者中存在CALR基因突变或许也会产生这种作用并最终导致细胞的过度增殖。

CALR具有多种细胞功能，在JAK2及MPL基因突变阴性的ET患者中，该突变以较高的频率出现，并表现出不同的临床表现及预后，为我们了解ET提供了新方向。CALR基因可通过不同途径影响细胞增殖与分化，但确切的机制尚不清楚。目前，ET中发现的基因突变主要通过影响细胞因子受体信号通路、表观遗传异常以及RNA剪切异常等导致细胞癌变。CALR基因突变可影响STAT通路，但更深的机制尚不清楚。因此，CALR基因突变及其相关突变的动物模型，以及疗效之间的对比及长期预后尚需进行更深入的研究。

JAK2基因突变有助于ET的诊断，目前多种用于治疗ET的JAK2激酶抑制剂正处于临床开发的不同阶段。由于CALR基因也涉及JAK-STAT通路，故已有研究应用干扰素治疗CALR突变阳性的ET，结果显示干扰素治疗可以抑制突变克隆并取得持续的血液学缓解。这说明干扰素可以作为这类疾病的靶向治疗药物^[32]。因此，CALR基因突变的发现可能是进一步了解JAK2基因突变阴性ET的重大突破，有助于提高其现有诊断方法，并补充世界卫生组织(WHO)对这些疾病的诊断标准，同时可能导致ET患者治疗方案的革新。