对3种不同原理测定糖化血红蛋白(HbA1c)的结果进行比对和偏移评估。
根据美国临床和实验室标准协会(CLSI) EP9－A3文件，应用Roche Tina－quant免疫比浊法、Sebia Minicap FP毛细管电泳法和Trinity Biotech Premier Hb 9210™高效液相色谱法(HPLC)3种不同原理的检测系统分别单次测定40份线性范围内静脉血标本的HbA1c，其结果进行两两比较，绘制散点图和偏差图。并对结果进行极端学生化偏差(ESD)法离群值检验，选取最佳回归模型拟合回归方程，并计算医学决定水平处的偏移，以1/2允许总误差(Tea)为可接受标准。
通过目测散点图及ESD法确认40份样本HbA1c检测结果具有良好的相关性，未发现离群值点。根据百分比差值偏差图、百分比差值排序偏差图、数值偏差图和排序偏差图特征选取了普通线性回归(OLR)[Roche(X)和sebia(Y1)]、加权最小二乘法(WLS)[ Roche(X)和Trinity (Y2)]以及戴明回归(Deming)[Sebia(Y1)和Trinity(Y2)]4种回归分析模型进行拟合，其回归方程分别为Y1＝－0.420 3＋1.052 7X，Y2＝－0.174 0＋1.027 0X，Y2＝0.423 1＋0.959 0Y1。并将HbA1c两个医学决定水平10%、16%分别代入方程中，Roche(X)和sebia(Y1)比对系统偏移为1.06%、2.61%；Roche(X)和Trinity (Y2)比对系统偏移为0.96%、1.60%；Sebia(Y1)和Trinity(Y2)比对系统偏移为0.13%、－1.47%，其偏移均小于可接受标准。
Sebia Minicap FP全自动毛细管电泳法、Trinity Biotech Premier Hb 9210™ HPLC法与Roche Tina－quant免疫比浊法3种不同方法测定HbA1c的结果具有可比性。
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糖化血红蛋白(HbA1c)是判断糖尿病患者血糖控制效果的理想指标，2010年美国糖尿病协会将其列入糖尿病诊断标准。目前临床实验室普遍采用的糖化血红蛋白测定方法有多种，按原理可分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构不同，如免疫法、亲和层析法及酶法等。在国际临床化学与医学实验室联盟(IFCC)及美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)标准化工作推动下，糖化血红蛋白的测定方法均应以"HbA1c"或相当于"HbA1c"报告结果[1,2]。但临床应用过程中，不同仪器、不同方法以及不同实验室的检测能力不同，导致HbA1c检测结果间仍有较大差异，这也是我国暂未把HbA1c作为糖尿病诊断标准的原因之一，因此探讨不同方法间的可比性显得尤为重要。
2013年8月美国临床和实验室标准协会(CLSI)发布了EP9－A3《用患者样本进行方法学比对及偏移评估——批准指南；第三版》文件[3]，相比于EP9－A2等以前的几个版本，其文件架构、实验方案、标本检测、统计方法作了很大修改，应用范围更广、可操作性更强、方案设计更科学。EP9－A3仅需40份标本随机单次测定即可，且文件同时提供OLR、WLS、Deming、Passing－Baklok 4种回归模型用于比对结果分析，实验室需先对比对结果的散点图和偏差图进行目测判断，根据方法间差值的变化特性选择适当的模型进行拟合回归方程，随后利用医学决定水平处浓度获得相应的系统偏移，用于判断结果的可比性。EP9－A3为临床实验室提供了最新的方法学比对和偏移评估指南。本研究参照EP9－A3文件，对Roche Tina－quant免疫比浊法、Sebia Minicap FP毛细管电泳法和Trinity Biotech Premier Hb 9210™高效液相色谱法(HPLC)HbA1c检测结果进行了系统间的方法比对和偏移评估，供同行参考。
收集广东省中医院住院及门诊患者乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA－K2)抗凝新鲜全血，采样后4 ℃保存(≤5 d)。如果需要保存更久，则将样本分装保存于－80 ℃，可在4 ℃条件下冻融，24 h内完成检测。其HbA1c浓度在测量线性范围内均匀分布，不同浓度所占比例符合EP9－A3文件要求。
日立7180生化分析仪及Roche Tina－quant HbA1c试剂(批号：603946－01)、校准品(批号：180036)和质控品(Level 1：180038；Level 2：181189)；Sebia Minicap FP毛细管电泳仪及原装配套试剂(溶血素批号：02094/80，缓冲液批号：22074/80)、校准品(批号：04093/01、05093/01)和质控品(Level 1：27063/01；Level 2：28063/01)；Trinity Biotech Premier Hb 9210™分析仪及原装配套试剂(批号：5014)、校准品(批号：5220 )和质控品(Level 1：5531；Level 2：5532)。
(1)本实验室现有的日立7180生化分析仪、Roche Tina－quant HbA1c免疫比浊法测定HbA1c的系统(X)为参比系统，新引进的专用HbA1c测定系统Sebia Minicap FP毛细管电泳法系统(Y1)和Trinity Biotech Premier Hb 9210™系统(Y2)为待评系统。(2)新引进Sebia Minicap FP毛细管电泳法系统(Y1)和Trinity Biotech Premier Hb 9210™系统(Y2)进行比对分析。因此本研究建立的3个比对系统分别为Roche(X)与sebia(Y1)，Roche(X)与Trinity (Y2)，Sebia(Y1)与Trinity(Y2)。
按照CLSI EP9－A3文件要求，各检测系统分别随机测定40份糖化血红蛋白样本，每份样本每种方法单次测定，并记录测定结果。测定之前对仪器进行校准，室内质控结果在控。如有离群值标本，则排除该标本并补充相应浓度标本测定。
按照EP9－A3文件要求及文献[4]内容中描述的广义极端学生化偏差(ESD)方法对测定结果进行离群值检查。
绘制偏差图、散点图，根据分析方法间散点图和偏差图所呈现的潜在特征，选择最佳回归模型(OLR、WLS、Deming、Passing－Baklok)对各比对系统结果进行拟合分析，并计算医学决定水平处的偏移，以≤1/2 Tea(± 4%)(国家临床检验中心室间质评允许总误差)为可接受标准。
采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17.0和MedCalc软件分析数据。计量数据以
±s表示，各比对系统回归和偏移分析选取最佳回归模型进行计算，显著性检验采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
由散点图(图1)可见，3种方法40份样本HbA1c检测结果具有良好的相关性，目测无离群值。
根据EP9－A3中描述的ESD法进行离群值定量检验，具体步骤按照EP9－A3文件及文献[4]内容中所述进行，未发现离群值点，结果见表1。
不同比对系统间离群值计算结果
不同比对系统间离群值计算结果
| 比对系统 | d－(%) | SD(%) | ESD | λi | 方法间偏差(%) | 是否离群值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| X与Y1 | －0.010 4 | 0.035 5 | 2.846 4 | 2.93 | 12.50 | 否 |
| X与Y2 | 0.004 4 | 0.020 7 | 1.035 0 | 3.05 | 4.00 | 否 |
| Y1与Y2 | 0.031 0 | 0.031 0 | 2.180 1 | 3.05 | 9.52 | 否 |
注：X为Roche Tina－quant系统；Y1为Sebia Minicap FP系统；Y2为Trinity Biotech Premier Hb 9210™系统；d－为平均值；SD为标准差；ESD为广义极端学生化偏差；λi为临界值
参照EP9－A3文件对无离群值的40份血清样本HbA1c结果绘制百分比差值偏差图、百分比差值排序偏差图(图2)、数值偏差图和排序偏差图等。Roche Tina－quant免疫比浊法与Sebia Minicap FP毛细管电泳法比较(图2A，图2B)，测定结果总体呈现线性变化趋势，故选择OLR回归分析模型进行拟合；Roche Tina－quant免疫比浊法与Trinity Biotech Premier Hb 9210™ HPLC法比较(图2C，图2D)测定结果总体呈现恒定变化，故选择WLS模型进行拟合；Sebia Minicap FP毛细管电泳法与Trinity Biotech Premier Hb 9210™ HPLC法比较(图2E，图2F)，除低浓度波动较大外，总体具有恒定变化，故选择Deming模型进行拟合。
EP9－A3提供了OLR、WLS、Deming、Passing－Baklok 4种模型进行回归分析，根据3种方法测定结果数值变化特征，选取最佳回归模型进行拟合，将HbA1c两个医学决定水平10%、16%分别代入选取的最佳回归模型拟合方程，其偏移均小于可接受标准(表2)。
HbA1c比对不同回归模型医学决定水平处的偏移结果
HbA1c比对不同回归模型医学决定水平处的偏移结果
| 比对系统 | 回归模型 | 回归方程 | 医学决定水平 | 估计值(%) | 偏移(%) | 比例偏移(%) | 可接受范围 | 是否可接受 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| X与Y1 | OLR | Y1＝－0.420 3＋1.052 7X | 10% | 10.11 | 0.11 | 1.06 | ±4% | 接受 |
| 16% | 16.42 | 0.42 | 2.61 | ±4% | 接受 | |||
| X与Y2 | WLS | Y2＝－0.174 0＋1.027 0X | 10% | 10.10 | 0.10 | 0.96 | ±4% | 接受 |
| 16% | 16.26 | 0.26 | 1.60 | ±4% | 接受 | |||
| Y1与Y2 | Deming | Y2＝0.423 1＋0.959 0Y1 | 10% | 10.01 | 0.01 | 0.13 | ±4% | 接受 |
| 16% | 15.77 | －0.23 | －1.47 | ±4% | 接受 |
注：X为Roche Tina－quant系统；Y1为Sebia Minicap FP系统；Y2为Trinity Biotech Premier Hb 9210™系统。
近年来，HbA1c在糖尿病的筛查、诊断和治疗中发挥着极为重要的作用，同时也对糖尿病慢性并发症、心血管疾病、视网膜病变、肾损伤、白内障、妊娠糖尿病等疾病的诊断具有非常重要的意义[5,6]。
本研究参考CLSI EP9－A3文件对本实验室检测HbA1c的3种方法进行比较分析。EP9－A3提供测定结果方法间拟合比较的4种回归模型，不同模型有其适用性，研究者可先根据散点图和偏差图进行目测分析，并以方法间测定结果差值的变化特性选取最佳回归模型进行拟合，通过计算获得医学决定水平处的系统偏移[7]。因工作和课题研究需要，实验室在原用日立7180生化分析仪、Roche Tina－quant HbA1c免疫比浊法测定HbA1c的系统基础上，新引进两台不同方法的专用HbA1c测定系统，即Sebia Minicap FP毛细管电泳法系统和Trinity Biotech Premier Hb 9210™ HPLC系统。因本实验室为ISO15189认可实验室，根据ISO15189：2012技术要素及实验室管理办法等检验结果可比性要求，实验室使用两套及以上检测系统检测同一项目时，应有比对数据表明其检测结果的一致性。由于Roche Tina－quant HbA1c免疫比浊法在实验室已经使用较长时间，其室间质评成绩优秀，不精密度<2%，可作为参比系统，新引进仪器先与其进行比对分析。另本实验室建立的3种不同HbA1c测定方法均通过美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)认证，理论上，每种方法均具有较好的特异性和准确性，所以在实验设计时，新引进的两种方法之间亦进行了比对分析。按照CLSI EP9－A3文件要求绘制了3种方法间测定结果的散点图，目测显示无明显离群值点，再用ESD法确认。进一步分析方法间百分比差值偏差图、百分比差值排序偏差图，数值偏差图和排序偏差图的变化特征，发现Roche Tina－quant免疫比浊法与Sebia Minicap FP毛细管电泳法测定结果呈现线性变化趋势，Roche Tina－quant免疫比浊法与Trinity Biotech Premier Hb9210™ HPLC法比较时测定结果总体呈现恒定SD变化，而Sebia Minicap FP毛细管电泳法与Trinity Biotech Premier Hb9210™ HPLC法比较除低浓度波动较大外，总体具有恒定SD变化。因此本研究对上述3种方法间的比较分析分别选取了OLR、WLS以及Deming回归分析模型进行拟合。将HbA1c两个医学决定水平10%、16%分别代入回归方程中，结果显示，其偏移均小于可接受标准，表明3种方法HbA1c测定相关性和一致性较好，结果具有可比性，均能满足临床需求。
糖化血红蛋白测定方法众多，不同方法会受到一些干扰因素如血红蛋白病、衍生血红蛋白、红细胞生存周期的异常及药物等影响。实验室应知晓某些患者可能需要用某种特异的HbA1c测定方法。基于日常工作和课题研究需要，本实验室选择的3种测定方法亦各有优缺点，NGSP网页含有更新的血红蛋白变异体对不同方法干扰信息，临床和实验室人员可随时查阅。检验人员应掌握测定方法对于各种变异体检测的局限性以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并在报告中为医生作出提示。我国南方为地中海贫血和血红蛋白病高发地区，应尽量避免选择基于电荷差异的离子交换HPLC法，若已使用此法，在发出报告前须仔细检查色谱图，以避免发出不准确的结果误导临床[6]。同时，实验室在准备使用一个新的方法测定临床样品前，应对方法的分析性能进行验证[8]；工作中，加强室内质控和室间质评工作，并定期进行方法间结果比对和偏移评估分析，保证检验质量。
