研究后肾间充质干细胞(MMSC)在肾缺血再灌注损伤中的作用。
将C57BL/6J雄鼠分为正常组(n＝5)和实验组(n＝30)。正常组作为术前对照，实验组进行肾缺血再灌注损伤手术处理，根据股静脉注射物不同，再分为两个亚组：缺血再灌注组(注射生理盐水，10 ml/kg)和细胞治疗组(注射含5×105个MMSC的生理盐水，10 ml/kg)。实验组术后12、24、72 h和正常组各取5只小鼠全血和肾脏，检测血清肌酐(SCr)水平，分析肾组织病理染色结果和肾小管Paller评分，评估MMSC的作用。采用反转录－聚合酶链反应法检测肾组织的微小RNA－26a(miR－26a)水平，观察miR－26a在各组间的差异。
(1)缺血再灌注组和细胞治疗组术后12、24、72 h的SCr均高于正常组，且术后24 h的SCr均高于术后12、72 h，差异均有统计学意义(均P<0.05)；术后12、24、72 h缺血再灌注组和细胞治疗组间SCr差异无统计学意义(均P>0.05)。(2)缺血再灌注组和细胞治疗组术后12、24、72 h的肾小管Paller氏评分均高于正常组，且24 h评分>72 h评分>12 h评分(均P<0.05)；在术后24 h，细胞治疗组的Paller氏评分低于缺血再灌注组[(57.2±6.3)比(70.8±14.8)分](P<0.05)；与正常组和细胞治疗组相比，缺血再灌注组术后24 h可见明显的蛋白管型，肾小管萎缩、肿胀。(3)缺血再灌注组和细胞治疗组术后12、24 h的肾组织miR－26a相对表达量均低于正常组(均P<0.05)；在术后24、72 h，细胞治疗组肾组织miR－26a相对表达量分别是0.416±0.139、1.152±0.239，明显高于缺血再灌注组(0.244±0.067、0.855±0.038，均P<0.05)，且肾组织miR－26a的相对表达量与SCr呈负相关(r＝－0.5，P<0.05)。
MMSC对肾缺血再灌注损伤有一定的修复作用，伴随着肾组织miR－26a表达量的增加。
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全球有10%的慢性肾脏疾病进展为慢性肾功能不全、尿毒症。对于终末期肾脏病，肾移植的治疗效果优于透析，能提高生存率和生存质量，因此肾移植是目前肾衰竭患者最有效的治疗方式[1,2,3]。缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是影响移植肾最主要的抗原非依赖性非免疫因素之一，它参与多种肾脏疾病的发生发展，如急慢性肾衰竭、移植后急慢性排斥反应[4]。近年来，干细胞的治疗成为防治IRI研究的热点之一。
干细胞具有多向分化潜能和自我更新的特点，已有不少报道骨髓干细胞修复肾脏损伤的研究[5,6,7,8]，但存在一定争议。相比之下，后肾间充质干细胞(metanephros mesenchymal stem cells，MMSC)是一类直接参与肾脏发生的干细胞，MMSC和来源于中肾导管的输尿管芽(UB)交互作用发育成哺乳类动物的后肾。此外，有研究证明MMSC在原位能长出新的肾脏[9]，和UB一起移植，MMSC能分化形成具有正常肾脏的结构[10]。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长19～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA[11]。微小RNA－26a(miR－26a)在多种恶性肿瘤中出现下调，如肝癌[12]、鼻咽癌[13]、肺癌[14,15]、乳腺癌[16]和Burkitt淋巴瘤[17], miR－26a过表达能引起细胞凋亡[12,13,15,16,17]。最近研究发现，miR－26a的过表达能缓解IRI [18]。
本研究通过建立小鼠肾IRI模型，观察MMSC对肾IRI的作用以及miR－26a的表达差异，初步探讨MMSC与miR－26a之间的联系。
SPF级C57BL/6健康雄性小鼠，8～10周龄，体质量20～25 g，北京维通利华实验动物技术有限公司购置，SCXK(京)2012－0001，由浙江大学医学院附属第一医院实验动物中心统一饲养。动物实验伦理批号：zju2015－049－01。
异氟烷(河北一品制药有限公司)、Ⅴ型胶原酶(美国Sigma公司)、胎牛血清(FBS)及DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司)、红细胞裂解液(达文生物有限公司)、生理盐水(杭州民生药业有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS)(吉诺生物医药技术有限公司)。
实验小鼠分为正常组(n＝5)和实验组(n＝30)。正常组予开腹但不进行肾IRI处理。实验组进行肾IRI处理，根据实验过程中接受的注射物不同，实验组小鼠再分为两个亚组：(1)缺血再灌注组：IRI处理后立刻股静脉注射10 ml/kg的生理盐水；(2)细胞治疗组：IRI处理后立刻股静脉注射10 ml/kg的含5×105个MMSC的生理盐水。正常组和实验组术后12、24、72 h各取5只小鼠全血和肾脏进行下一步实验。
小鼠术前用吸入式小动物麻醉机进行麻醉，麻醉试剂为浓度2%的异氟烷，氧气流速0.4 L/min。麻醉后取腹正中切口，充分暴露右肾，显微镜下大尖镊分离肾筋膜，游离肾蒂，在靠近肾脏处电离器切除肾蒂，同样方法暴露左肾，用无创血管夹阻断左侧肾动脉35 min，期间置于20～25 ℃温箱内并维持吸入性麻醉，切口覆以生理盐水浸润的纱布，到阻断时间则取夹缝合。
将成年健康C57BL/6小鼠按雌雄2∶1合笼，次日分笼，得12.5 d的孕鼠。颈椎脱臼法处死孕鼠，取胚胎得到胚鼠，在解剖显微镜下获取胚肾，并置于4 ℃预冷的DMEM培养基中，用无菌刀片切碎小鼠胚胎肾组织后加入0.1%的胶原酶37 ℃下消化15 min，以胎牛血清终止消化，轻轻吹打细胞后经BD Falcon 40 μm细胞过滤器过滤，400 ×g离心10 min，红细胞裂解液去除红细胞，PBS重悬后，获得胚胎MMSC悬液，细胞计数，最后生理盐水重悬。
经小鼠眼球取正常组及实验组术后12、24和72 h全血，2 000 ×g离心10 min，收集上层血清，使用干式生化仪检测SCr水平，评价肾脏功能。
从－80 ℃保存的各组小鼠肾组织中取半粒绿豆大小组织，装于加入Trizol的EP管中过夜，第2日提取肾组织总RNA。Nanodrop测定提取的总RNA量。miR－26a与标准化内参U6小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)共同逆转录，逆转录产物染料法进行实时定量PCR反应，最后在结果中计算miR－26a的相对表达量。
取各组小鼠术后24 h肾组织样本，经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后，制成石蜡切片，进行HE、PAS染色，初步评价组织病理学情况。此外，在HE染色的肾组织病变严重处，采用Paller氏评分评估肾小管损伤程度，即在400倍高倍镜下，取10个高倍镜视野合计100个肾小管，肾小管明显扩张、细胞扁平(1分)；肾小管内出现管型(2分)；肾小管官腔内有脱落、坏死的细胞，但未成管型或细胞碎片(1分)；上皮细胞颗粒变性(1分)；空泡变性(1分)；细胞核固缩(1分)。
数据分析采用SPSS 19.0统计软件。计量资料用
±s表示。多组均数的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。Graphpad Prism 5.0统计软件进行作图。
如表1所示，缺血再灌注组术后12、24、72 h的SCr均高于正常组，且术后24 h的SCr高于术后12、72 h(均P<0.05)；术后12和72 h之间SCr差异无统计学意义。细胞治疗组术后12、24、72 h的SCr均高于正常组，且术后24 h的SCr高于术后12、72 h(均P<0.05)；术后12和72 h之间SCr差异无统计学意义。术后12、24、72 h，缺血再灌注组和细胞治疗组间的SCr差异均无统计学意义(P>0.05)。
各组小鼠不同时间点的血清肌酐水平(n＝5，
±s)
各组小鼠不同时间点的血清肌酐水平(n＝5，±s)
| 组别 | 血清肌酐(μmol/L) | |
|---|---|---|
| 正常组 | 28.8±11.4 | |
| 缺血再灌注组 | ||
| 术后12 h | 194.8±41.8ab | |
| 术后24 h | 415.2±125.8a | |
| 术后72 h | 250.2±143.9ab | |
| 细胞治疗组 | ||
| 术后12 h | 197.2±41.8ab | |
| 术后24 h | 315.0±26.1a | |
| 术后72 h | 158.4±119.6ab | |
注：与正常组比较，aP<0.05；组内与术后24 h比较，bP<0.05
如表2所示，缺血再灌注组和细胞治疗组术后12、24、72 h的肾小管Paller氏评分均高于对照组，且24 h评分高于72 h评分，72 h评分高于12 h评分(均P<0.05)；在术后24 h，细胞治疗组的Paller氏评分低于缺血再灌注组(P<0.05)。与正常组和细胞治疗组相比，缺血再灌注组术后24 h可见明显的蛋白管型，肾小管萎缩、肿胀(图1)。
各组小鼠不同时间点的肾小管评分(n＝5，
±s)
各组小鼠不同时间点的肾小管评分(n＝5，±s)
| 组别 | 肾小管评分(分) | |
|---|---|---|
| 正常组 | 10.0±2.6 | |
| 缺血再灌注组 | ||
| 术后12 h | 25.0±4.0a | |
| 术后24 h | 70.8±14.8ab | |
| 术后72 h | 52.6±7.4abc | |
| 细胞治疗组 | ||
| 术后12 h | 22.4±4.6a | |
| 术后24 h | 57.2±6.3abd | |
| 术后72 h | 34.8±9.2abc | |
注：与正常组比较，aP<0.05；组内：与术后12 h比较bP<0.05,与术后24 h比较cP<0.05；与同一个时间点缺血再灌注组比较，dP<0.05
如表3所示，缺血再灌注组术后12、24 h的肾组织miR－26a相对表达量均低于正常组，且72 h肾组织miR－26a高于12、24 h肾组织miR－26a(均P<0.05)；细胞治疗组术后12、24 h的肾组织miR－26a相对表达量均低于正常组，且72 h肾组织miR－26a高于12、24 h肾组织miR－26a(均P<0.05)；在术后24、72 h，细胞治疗组肾组织miR－26a相对表达量明显高于缺血再灌注组(均P<0.05)。
各组小鼠不同时间点的肾组织miR－26a相对表达量(n＝5，
±s)
各组小鼠不同时间点的肾组织miR－26a相对表达量(n＝5，±s)
| 组别 | 肾组织miR－26a相对表达量 | |
|---|---|---|
| 正常组 | 0.920±0.194 | |
| 缺血再灌注组 | ||
| 术后12 h | 0.523±0.049ab | |
| 术后24 h | 0.244±0.067ab | |
| 术后72 h | 0.855±0.038 | |
| 细胞治疗组 | ||
| 术后12 h | 0.512±0.196ab | |
| 术后24 h | 0.416±0.139abc | |
| 术后72 h | 1.152±0.239c | |
注：miR－26a：微小RNA－26a；与正常组比较，aP<0.05；组内与术后72 h比较，bP<0.05；与同一个时间点缺血再灌注组比较，cP<0.05
相关性分析显示，小鼠的肾组织miR－26a与SCr呈负相关(r＝－0.5，P<0.05) (图2)。
尽管肾移植取得很大的进展，但是肾功能不全的发生率仍较高，IRI一直是肾移植不可避免的一个关键问题。所以，减少IRI，对防止急性排斥反应的发生及促进移植肾延迟恢复，进而提高移植肾长期生存率具有重要意义。
本研究通过观测术后不同时间点SCr和病理的改变，确定小鼠肾IRI模型是否成功。小鼠进行肾IRI手术处理后，SCr开始逐渐上升，在24 h达到高峰后逐渐下降，但仍高于SCr正常水平，且术后24 h的肾脏病理变化也最显著[14]。本次研究结果中，无论是缺血再灌注组还是细胞治疗组中SCr的情况，与以往的一些研究结果一致，说明造模成功。SCr的这种变化趋势，很有可能因为小鼠自身修复系统的启动，肾脏损伤后期出现缓解。
肾IRI术后，肾组织的miR－26a开始逐渐降低，在72 h又有所回升。分析两者的关系，发现肾组织miR－26a表达量和SCr负相关，此结果与近年来提出的miR－26a过表达能缓解IRI[18]观点类似。
本研究发现，在术后24 h，尽管SCr差异无统计学意义，但细胞治疗组的Paller氏评分低于缺血再灌注组，MMSC对肾IRI仍有一定的修复作用；在术后24和72 h，细胞治疗组的miR－26a水平显著高于缺血再灌注组，由此可见，对于细胞的输注，肾组织miR－26a反应比SCr更敏感。所以，MMSC对肾IRI有一定的修复作用，伴随着肾组织miR－26a表达量的增加。
miRNA通过调节mRNA和蛋白的翻译来调节基因的表达，可见miRNA引起一些促炎因子的表达[19]，有研究表明miR－26a的过表达能提高叉头蛋白p3＋CD4＋调节细胞的表达，升高白细胞介素10，降低白细胞介素6、17和干扰素的水平[18]。我们猜测，MMSC对肾IRI有一定的修复作用，可能和miR－26a调控的下游基因的转录产物有关，只是具体涉及哪些细胞因子的变化有待进一步研究。
