探究摩罗丹对胃分泌功能的影响以及其治疗萎缩性胃炎的机制。
120只SPF级SD雄性大鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组、萎缩性胃炎模型组、摩罗丹低剂量治疗组及摩罗丹高剂量治疗组，30只/组。正常对照组每天2 ml生理盐水灌胃；其余3组每天20 mol/L脱氧胆酸钠1 ml、2%水杨酸钠1 ml灌胃，每10天给予N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)200 mg/kg灌胃1次，持续造模16周。模型成功后，正常对照组及模型组每天2 ml生理盐水灌胃；摩罗丹低剂量治疗组给予摩罗丹0.9 g·kg－1·d－1灌胃；摩罗丹高剂量治疗组给予摩罗丹1.8 g·kg－1·d－1灌胃，持续治疗12周，分别于治疗第4、8、12周末取材。观察摩罗丹治疗萎缩性胃炎的效果，同时检测胃黏膜的分泌功能，免疫组化方法测定大鼠胃黏膜胃泌素(GAS)分泌细胞(G细胞)及生长抑素(SS)分泌细胞(D细胞)的变化情况，酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定大鼠血清中GAS及SS水平。
与模型组相比，摩罗丹高剂量治疗组大鼠胃窦黏膜G、D细胞数在治疗8周后升高[(0.617±0.114)比(0.476±0.116)个/mm2，(0.504±0.084)比(0.369±0.148)个/mm2，均P<0.05]，摩罗丹低剂量治疗组大鼠胃窦黏膜G、D细胞数在治疗12周后升高[(0.674±0.129)比(0.528±0.103)个/mm2，(0.526±0.087)比(0.371±0.058)个/mm2，均P<0.05]；摩罗丹高剂量治疗组治疗8周、低剂量治疗组治疗12周后血清GAS高于模型组[(1.313±0.080)比(0.964±0.080)ng/ml，(1.202±0.124)比(0.909±0.054)ng/ml，均P<0.01]；摩罗丹高、低剂量治疗组血清SS水平均在治疗8周后低于模型组[(2.376±0.199)、(2.238±0.155)比(2.605±0.183)ng/ml；均P<0.05]。
摩罗丹可通过修复萎缩性胃炎大鼠胃黏膜G、D细胞，升高血清GAS水平治疗萎缩性胃炎。
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慢性萎缩性胃炎( chronic atrophic gastritis，CAG)[1]是一种以胃黏膜固有腺体数量减少或消失(伴或不伴有肠化生)为病理特点的消化系统常见疾病。2011年一项针对8 892例有消化道症状的慢性胃炎患者的横断面研究表明我国CAG的患病率较高[2]。同时，研究表明在慢性胃炎的人群中CAG与胃癌的发病率呈正相关[3]。因此，如果能在CAG早期进行积极的治疗，通过逆转胃黏膜腺体的萎缩、肠化生等延缓其病变进程，不仅对于疾病本身，同时对于胃癌的早期预防也具有重要的意义。本研究拟通过摩罗丹治疗CAG大鼠，观察大鼠胃黏膜胃泌素(gastrin，GAS)分泌细胞(G细胞)、生长抑素(somatostatin，SS)分泌细胞(D细胞)及血清中GAS、SS水平的变化，探索摩罗丹治疗CAG的可能机制，为摩罗丹临床治疗CAG提供实验依据。
成熟SPF级SD雄性大鼠，120只，体质量(200±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。饲养条件：照明控制设定为12 h明暗交替，恒温(20～26 ℃)、恒湿(50%～65%)的空气洁净层流架内，笼具、垫料、饲料和饮水均经高压蒸汽灭菌，并在无菌条件下适时更换。摩罗丹浓缩丸粉末(国药准字号Z200900132)购自邯郸制药股份有限公司；水杨酸钠(批号S3007-500G)、脱氧胆酸钠(批号30970-100G)购自美国Sigma公司；N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG，批号M0527)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；兔抗大鼠GAS抗体(批号bs-1189R)购自北京博奥森公司；兔抗大鼠SS抗体(批号BAO124)购自武汉博士德公司；二抗：超敏两步法免疫组化检测试剂(编号PV-9001)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒(GAS、SS)购自上海蓝基生物科技有限公司。
120只SPF级SD雄性大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、摩罗丹低剂量治疗组及摩罗丹高剂量治疗组4个组，30只/组。正常对照组每天2 ml生理盐水灌胃；其余3组每天20 mol/L脱氧胆酸钠1 ml，2%水杨酸钠1 ml灌胃，MNNG 200 mg/kg每10天1次灌胃，持续造模16周[4,5]。
模型成功后，正常对照组及模型组每天2 ml生理盐水灌胃；摩罗丹低剂量治疗组给予摩罗丹0.9 g·kg－1·d－1灌胃；摩罗丹高剂量治疗组给予摩罗丹1.8 g·kg－1·d－1灌胃，持续治疗12周，期间大鼠正常进食饮水。分别于治疗第4、8、12周末次给药后禁食不禁水12 h后进行标本取材(实验动物伦理批号：1115032300283)。10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，注入EDTA抗凝管中混匀，4 ℃ 3 000 r/min，离心半径135 mm，离心10 min取血清；剖腹取出全胃，沿大弯侧切开，生理盐水冲洗，分别于胃底、体、窦及小弯处取材，4%甲醛固定，常规石蜡包埋。
采用Polink-2 plus®超敏二步法，石蜡切片脱蜡至水，在Tris/EDTA修复液(pH 9.0)高温高压修复20 min，自然冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，2 min×3次；3% H2O2避光封闭20 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加一抗，GAS一抗(1∶500)和SS一抗(1∶200)，4 ℃过夜；次日PBS冲洗，2 min×3次，滴加Polink-2 plus试剂1，室温30 min，PBS冲洗，2 min×3次，滴加试剂2，室温60 min，PBS冲洗，2 min×3次；DAB显色；蒸馏水漂洗，苏木精复染2 min，乙醇分化5 s，返蓝30 s；脱水、透明、封片。在400倍光学显微镜下每张切片按等距抽样原则随机摄取3个视野，应用Image-Pro Plus 6.0软件计算阳性细胞数与面积比(个/mm2)。
按照标准品的次序分别加入100 μl的标准品溶液于空白微孔中，空白微孔中加入100 μl待测血清，空白对照加入100 μl的蒸馏水，在各孔中加入50 μl的酶标记溶液(不含空白对照孔)，将酶标板用封口胶密封后，37 ℃孵育1 h，充分清洗酶标板5次，吸水纸拍干，各孔分别加入显色剂A、B各50 μl；20～25 ℃下避光10 min；加入50 μl终止液，终止反应。在酶标仪450 nm波长下测量，计算血清中GAS及SS含量。
采用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理分析。正态分布的计量资料采用
±s表示，多组数据比较采用单因素方差分析，再两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
正常对照组：为正常胃窦黏膜结构，主要由黏液细胞、G细胞及D细胞组成；模型组：造模16周时，萎缩主要发生在大鼠胃窦部，胃窦黏膜层变薄，固有腺体数目明显较少，结构紊乱，黏膜肌层增厚，插入固有腺体层，可见大量炎症细胞浸润；摩罗丹低剂量治疗组：治疗12周，固有层腺体萎缩改善，黏膜基层增厚病变减轻，黏膜基层仍明显可见炎症细胞浸润；摩罗丹高剂量治疗组：治疗12周，固有层腺体萎缩明显改善，黏膜基层散在炎症细胞浸润(图1)。
G、D细胞阳性反应均为胞质内棕黄色，胃窦部G细胞较多，主要分布在胃窦黏膜腺体的下2/3，偶见于黏膜上部；D细胞数量较G细胞少，主要分布在胃窦黏膜的下1/3，偶见于黏膜中上部。D细胞形态与G细胞相似，可呈圆形、三角形或不规则。与模型组相比，摩罗丹高剂量治疗组治疗8周可明显提高CAG大鼠胃黏膜G、D细胞数(均P<0.05)，低剂量治疗组治疗12周亦可明显提高CAG大鼠胃黏膜G、D细胞数(均P<0.05)(图2，图3、表1)。
各组大鼠胃窦黏膜G、D细胞密度(n＝10，
±s，个/mm2)
各组大鼠胃窦黏膜G、D细胞密度(n＝10，±s，个/mm2)
| 组别 | G细胞 | D细胞 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 4周 | 8周 | 12周 | 4周 | 8周 | 12周 | |
| 正常对照组 | 0.755±0.105 | 0.717±0.113 | 0.641±0.075 | 0.526±0.087 | 0.515±0.053 | 0.516±0.087 |
| 模型组 | 0.518±0.052 | 0.476±0.116 | 0.528±0.103 | 0.392±0.115 | 0.369±0.148 | 0.371±0.058 |
| 摩罗丹低剂量治疗组 | 0.539±0.061 | 0.522±0.085 | 0.674±0.129a | 0.430±0.061 | 0.400±0.138 | 0.526±0.087a |
| 摩罗丹高剂量治疗组 | 0.593±0.147 | 0.617±0.114a | 0.677±0.125a | 0.429±0.142 | 0.504±0.084a | 0.501±0.084a |
注：同时间内，与模型组比较，aP<0.05
与模型组相比，摩罗丹高剂量治疗组治疗8周可明显提高CAG大鼠血清GAS水平(P<0.01)，低剂量治疗组治疗12周亦可提高CAG大鼠血清GAS水平(P<0.01)；与模型组相比，摩罗丹高、低剂量治疗组治疗8周均能明显降低CAG大鼠血清SS水平(均P<0.05)(表2)。
各组大鼠血清GAS、SS含量(n＝10，
±s，ng/ml)
各组大鼠血清GAS、SS含量(n＝10，±s，ng/ml)
| 组别 | GAS含量 | SS含量 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 4周 | 8周 | 12周 | 4周 | 8周 | 12周 | |
| 正常对照组 | 1.420±0.110 | 1.408±0.073 | 1.344±0.185 | 2.275±0.152 | 2.242±0.084 | 2.128±0.084 |
| 模型组 | 0.917±0.054 | 0.964±0.080 | 0.909±0.054 | 2.643±0.131 | 2.605±0.183 | 2.457±0.276 |
| 摩罗丹低剂量治疗组 | 1.082±0.069 | 1.178±0.139 | 1.202±0.124a | 2.428±0.168 | 2.238±0.155b | 2.278±0.115 |
| 摩罗丹高剂量治疗组 | 1.166±0.063 | 1.313±0.080a | 1.302±0.031a | 2.258±0.173 | 2.376±0.199b | 2.162±0.101b |
注：GAS：胃泌素；SS：生长抑素；同时间内，与模型组比较，aP<0.01，bP<0.05
1978年世界卫生组织(WHO)将CAG列为胃癌的癌前状态，在此基础上伴发的不完全型肠化生和(或)中、重度异型增生则被视为癌前病变。目前普遍接受的慢性胃炎演变为肠型胃癌的一般过程由Correa在1992年提出，即：浅表性胃炎→CAG→胃黏膜肠上皮化生→胃黏膜不典型增生→胃癌[7]。幽门螺杆菌感染、高盐饮食、免疫、十二指肠液反流及遗传等[8,9]都是CAG的危险发病因素。临床对于CAG的治疗主要为针对其病因所采取的措施，如幽门螺杆菌的根除、保护胃黏膜、增强胃动力及抗氧化剂的应用等[10]，西医对于CAG的治疗缺乏理想的治疗方法，中医药治疗CAG具有其独特的优势。
摩罗丹由百合、茯苓、玄参、乌药、泽泻、麦冬、当归、茵陈、延胡索、白芍、石斛、九节菖蒲、川芎、鸡内金、三七、白术、地榆、蒲黄等18味中药组成。多项临床随机对照研究表明，摩罗丹可以通过减轻黏膜炎症，调节胃动力，促进胃肠蠕动及胆汁排空等达到治疗CAG的作用，且在改善CAG患者上腹不适、嗳气等临床症状方面效果优于叶酸[11,12]。
胃黏膜分泌细胞主要由分布于胃体的壁细胞、主细胞，胃窦的G、D细胞组成。壁细胞又称泌酸细胞，主要分泌盐酸，主细胞主要分泌胃蛋白酶原，盐酸可使胃蛋白酶原变为具有活性的胃蛋白酶，同时胃蛋白酶对胃蛋白酶原也有激活作用。萎缩性胃体炎主要以胃体黏膜炎症及萎缩为病理特征，由于胃体部腺体的萎缩，壁细胞及主细胞数量减少，胃酸及胃蛋白酶原的分泌也随之下降，目前血清胃蛋白酶原Ⅰ及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ的检测是临床诊断萎缩性胃体炎的非侵入性检查之一[13]。萎缩性胃窦炎病变主要发生在胃窦部，对壁细胞及主细胞影响较小，胃酸分泌正常或稍低。大鼠CAG模型主要为萎缩性胃窦炎，各组大鼠胃酸及胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ的分泌并无明显变化(P>0.05)。
GAS是第一个被发现由胃黏膜上皮细胞分泌的多肽类激素，主要由分布于胃窦及十二指肠近端黏膜的G细胞分泌，具有广泛的生理学作用，可以通过刺激胃酸分泌、引起胃窦平滑肌收缩等参与消化系统内分泌及运动功能的调节[14,15]；SS最早被发现是在羊下丘脑产生的一种抑制生长激素分泌的因子，进一步研究证实SS对多种激素的分泌都具有抑制作用[16]。SS在胃内的分泌主要来源于分布于胃体和胃窦黏膜的D细胞，是抑制胃酸分泌的主要调节激素，同时还可抑制胃肠运动；GAS与SS之间存在着独特的相互调节作用，GAS可直接作用于D细胞刺激SS分泌，反之SS又可通过直接抑制GAS的分泌，抑制GAS基因的翻译、降低其mRNA的稳定性而减少GAS的生物合成，以及释放神经性一氧化氮合酶调节G细胞的凋亡，而达到对GAS分泌的抑制作用[17,18]。
CAG大鼠胃窦黏膜萎缩，黏膜内分泌功能随之下降，本研究结果显示CAG大鼠胃窦黏膜G、D细胞较正常对照组明显减少，而摩罗丹治疗改善胃窦黏膜萎缩后，G、D细胞数水平均有所上升，与黏膜修复情况相关；血清GAS水平变化与胃窦黏膜G细胞数变化平行，胃窦黏膜发生萎缩时G细胞数量减少，继而导致GAS分泌下降，血清含量减少，摩罗丹治疗后胃窦黏膜G细胞数有所恢复，血清GAS水平也随之上升。
有关血清SS水平的研究显示，CAG外周血中SS水平明显降低，分析其原因是由于胃黏膜萎缩导致D细胞数减少，继而引起外周血中SS的下降。然而ELISA结果显示CAG大鼠血清SS水平明显上升，与报道[19,20]相同。目前对于CAG胃窦黏膜D细胞减少而血清SS水平上升的机制并不是十分清楚。分析认为可能是由于CAG大鼠胃窦黏膜G细胞数和GAS分泌的减少，胃内酸性环境减弱，负反馈作用于G细胞，G细胞的代偿状态又进一步促使D细胞大量产生SS增加对胃泌素的抑制作用，继而加重血清GAS的下降。经摩罗丹治疗后，血清SS逐渐下降，继而减轻了其对GAS的抑制作用，此亦可提高血清GAS水平。
综上所述，摩罗丹可以通过减轻胃黏膜炎症，修复胃窦黏膜G、D细胞，控制和调节胃肠激素分泌，达到治疗CAG的效果。
