建立隐睾模型，观察分析乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)mRNA和蛋白在大鼠隐睾及正常睾丸组织中表达的变化及意义。
应用内分泌诱导法建立隐睾动物模型，分别取出生后第15天(幼年期)、第45天(青春期)和第90天(成年期)隐睾和正常子代雄鼠的睾丸组织，采用HE染色、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法、蛋白质印迹法、组织芯片免疫组化检测大鼠隐睾及正常睾丸组织中ALDH1A1 mRNA和蛋白水平表达的变化。
隐睾组幼年期、青春期和成年期ALDH1A1 mRNA表达量分别为1.01±0.19，1.60±0.32，0.75±0.16；正常组各期表达量分别为1.66±0.23，0.52±0.08，0.15±0.10，幼年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1 mRNA和蛋白的表达量低于正常组，青春期和成年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1 mRNA和蛋白的表达量高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。
ALDH1A1在大鼠睾丸的发生发育过程中，在不同年龄阶段有着不同的表达。ALDH1A1的表达与隐睾疾病的发生发展机制有着重要的联系。
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隐睾是睾丸下降异常的总称，是指睾丸未能按正常发育过程从腹部腹膜后下降至阴囊。流行病学分析，足月产的新生儿隐睾发生率为1%～3%，早产儿发生率为30%[1]。隐睾最主要的危害在于，它会导致男性不育和睾丸肿瘤[1,2]。目前，外国学者研究认为最佳的手术时间为出生后6～12个月[3]，然而虽然目前手术是治疗隐睾的首选治疗方案，但是手术却不能完全逆转对生育功能的影响，迄今为止，隐睾的病因及其发病机制仍然尚不明确，随着深入的研究，发现隐睾与多种基因密切相关[4]。ALDH1A1是乙醛脱氢酶(ALDH)家族的一种重要亚型，能够通过调节胚胎干细胞的基因转录，对其多潜能性和自我更新的能力，具有关键性的调控作用，保护细胞免受损害[5]，且具有增殖、分化及应激等细胞调控功能[6]。ALDH1A1 mRNA已经被证实存在于人体睾丸，肝脏和食管等中[7,8]。Bowles等[9]研究发现，ALDH1A1在鼠和鸡发育中的泌尿生殖脊细胞及睾丸组织中均有高表达，并与青春期和成年期支持细胞促进精子生成密切相关。由此可见，ALDH1A1在胚胎发育过程中，在泌尿生殖系统的形成及发育过程中可能起着至关重要的作用。而ALDH1A1在隐睾中的表达特点目前尚无相关研究报道。
内分泌诱导法是国际公认的隐睾造模方式之一，已有研究采用此方法造模检测隐睾组织雌激素受体α、β及miR－315a的表达变化[10,11]。为探究大鼠隐睾及正常睾丸组织中ALDH1A1 mRNA及蛋白的表达变化情况，本研究通过内分泌诱导方式，制备SD大鼠隐睾动物模型，采用HE染色观察隐睾大鼠睾丸组织的组织学改变，实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学法检测大鼠隐睾及正常睾丸组织中ALDH1A1的表达差异情况，探讨ALDH1A1表达的变化，为进一步研究其参与疾病的可能机制打下基础，并为临床上优化隐睾治疗方案奠定实验基础。
氟他胺购自Sigma公司，Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自日本TAKARA公司，引物购自上海生工技术有限公司，兔抗鼠ALDH1A1单克隆抗体购自Abcam公司，雌性SD大鼠(孕13 d)10只，由南通大学医学院实验动物中心提供。
于孕第14～20天，5只孕鼠每天腹腔注射7.5 mg氟他胺(溶于95%玉米油＋5%乙醇)，以出生后的子代雄鼠作为隐睾组；以5只健康孕鼠出生后的子代雄鼠为正常组，作为对照。
造模的5只孕鼠均于孕第21天分别产子14，15，14，14，15只，其中子代雄鼠分别为7，8，8，7，6只，共36只。于出生后15 d(幼年期)取10只子代雄鼠一侧睾丸，共10例标本；剩余26只出生后45 d(青春期)子代雄鼠中21只为双侧隐睾，3只单侧隐睾，2只正常，隐睾造模成功率92.3%，取10只双侧隐睾雄鼠一侧睾丸，共10例标本；于出生后90 d(成年期)取10只双侧隐睾雄鼠一侧睾丸，共10例标本。正常组分别取出生后第15天(幼年期)、第45天(青春期)和第90天(成年期)的睾丸组织各10例作为对照，60例标本均一半以福尔马林固定液固定，一半以－80 ℃保存。
组织常规固定、包埋、切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素浸染、分化、蓝化，伊红酒精浸染、脱水、透明，封片，显微镜下观察。
(1)总RNA的提取：取50～100 mg的睾丸组织按照RNA提取试剂盒提总RNA。(2)cDNA合成：应用PrimerScript RT reagent Kit逆转录试剂盒合成cDNA。(3)引物设计：根据GenBank提供的基因已知序列，应用Primer Premier 5.0软件设计引物。ALDH1A1上游引物：5′TCGGATTTAGGAGGCTGCAT 3′，下游引物：5′TGACAACCACGGTATTCCCA 3′，GAPDH上游引物：5′TCGTGGAGTCTACTGGCGTCT 3′，下游引物：5′CAACCTGGTCCTCAGTGTAG 3′。(4)Real－time PCR：使用Real－time PCR仪(Life Technologies)，按照PCR QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒说明书完成实时法荧光定量PCR，反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，共40个循环。GAPDH作为标准内参基因对照，使用ΔΔCT方法进行数据分析。
提取各期各组睾丸蛋白，测定蛋白浓度，加入Loading缓冲液，于沸水中煮10 min，采用10%十二烷基酸钠－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)分离胶和5%SDS－PAGE积层胶，常规电泳、转膜、封闭。孵育一抗(兔抗鼠ALDH1A1抗体，ab52492，1∶1 000，Abcam)，室温1～2 h或者4 ℃过夜，二抗(HRP标记的羊抗兔抗体，ab6721，1∶10 000，Abcam)，室温2 h。按照Ecl试剂盒显影、拍照保存。
采用Tissue Microarrayer System Quick Ray (UT06, UNITMA, Korea)工具，于每块组织蜡块取2 mm直径组织，置于新的石蜡模块中制作组织芯片，常规脱蜡，于枸橼酸盐缓冲液中行微波抗原修复，滴加3% H2O2－甲醇，室温孵育10 min，以切断内源性过氧化物酶的活性，用5%山羊血清封闭，孵育一抗(兔抗鼠ALDH1A1抗体，ab52492，1∶100，Abcam)，4 ℃过夜，二抗(HRP标记的羊抗兔抗体，ab6721，1∶1 000，Abcam)，室温30 min，DAB显色，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。组化结果由两人采用盲法观测评分，胞质染色为棕黄色为阳性结果，阳性细胞染色强度评分为0(阴性)，1(弱阳性)，2(中度阳性)，3(强阳性)，阳性细胞百分比评分为0～100%，两者的乘积为最终染色评分(0～300)。
实验数据采用SPSS 20.0软件分析，组间差异采用one－way ANOVA分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
与正常组睾丸相比较，各期隐睾组睾丸体积明显减小，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。
各期各组大鼠隐睾及正常睾丸组织体积大小(cm3)
各期各组大鼠隐睾及正常睾丸组织体积大小(cm3)
| 组别 | 幼年期 | 青春期 | 成年期 |
|---|---|---|---|
| 隐睾组 | 0.10±0.01 | 0.85±0.05 | 1.28±0.17 |
| 正常组 | 0.15±0.01 | 2.48±0.19 | 3.53±0.14 |
| P值 | 0.004 | 0.000 1 | <0.000 1 |
隐睾组幼年期，生精细胞和支持细胞较正常组减少，生精上皮细胞层变薄。隐睾组青春期及成年期，睾丸支持细胞形态异常，排列紊乱，生精上皮细胞变性坏死，生精小管萎缩(图1)。
以GAPDH为内参照，进行实时荧光定量PCR检测ALDH1A1 mRNA在大鼠隐睾及正常睾丸组织中的表达变化。隐睾组幼年期、青春期和成年期ALDH1A1 mRNA表达量分别为1.01±0.19，1.60±0.32，0.75±0.16；正常组各期表达量分别为1.66±0.23，0.52±0.08，0.15±0.10(图2)。幼年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1 mRNA的表达量明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；青春期和成年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1 mRNA的表达量明显高于正常组睾丸组织，差异有统计学意义(P<0.01)。
ALDH1A1蛋白在大鼠隐睾及正常睾丸组织中均有表达(图3A)。幼年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1蛋白表达较正常组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；青春期和成年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1蛋白表达较正常组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)(图3B)。
ALDH1A1蛋白在大鼠隐睾及正常睾丸组织中均有表达(图4)，表达于睾丸支持细胞的细胞质中，细胞质染色为棕黄色为阳性。幼年期隐睾组ALDH1A1蛋白表达呈阳性，正常组ALDH1A1蛋白表达较隐睾组明显升高，呈强阳性，差异有统计学意义(P<0.01)；青春期和成年期隐睾组中ALDH1A1蛋白表达呈强阳性或阳性，而青春期和成年期正常组中ALDH1A1蛋白散在表达于细胞质中，较隐睾组ALDH1A1蛋白表达明显降低，呈弱阳性，差异有统计学意义(P<0.01)(图5)。结果与PCR和蛋白质印迹一致。
由于目前国内外对隐睾的病因及睾丸损害的具体机制尚未清楚，因此对于隐睾的治疗，可以从隐睾发病发展机制方面着手研究，为隐睾的分子治疗提供新的方向。
研究认为，在对大鼠胎儿时期的睾丸给予外源的RA，能有完全抑制精索的形成[12]，抑制中肾细胞的迁徙，抑制睾丸支持细胞的分化和性原细胞的生存[13]。另外，在体内和体外研究证明，在鼠的睾丸发育过程中，RA会引起生殖细胞过早的进入减数分裂和细胞凋亡[14]。Bowles等[9]研究提出，ALDH1A1高表达于胎鼠睾丸组织中，且另一种在胎鼠睾丸组织中高表达的细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzyme，CYP26B1)能降低内源性RA，在CYP26B1基因敲除雄性性腺中ALDH1A1表达降低，因此提出假设，ALDH1A1高表达于胎鼠睾丸组织中，这种高表达现象从某种程度上，暗示了RA的耗尽。由此看出，ALDH1A1表达在睾丸的发生和发育过程中具有重要意义。而ALDH1A1在隐睾中表达特点目前尚缺乏研究。
本研究通过实时荧光定量PCR检测结果示大鼠隐睾及正常睾丸组织中均有不同程度的ALDH1A1 mRNA的表达。幼年期隐睾组睾丸组织中表达量明显低于正常组，蛋白质印迹和免疫组化结果与PCR一致。由此我们可以分析，由于正常睾丸幼年期发育过程中，ALDH1A1的呈高表达，暗示着RA的耗尽，而与隐睾睾丸相比，隐睾中ALDH1A1的表达降低，可能意味着RA的剩余，RA又会抑制精索的形成，抑制中肾细胞的迁徙，抑制睾丸支持细胞的分化和性原细胞的生存，引起生殖细胞过早的进入减数分裂和细胞凋亡，由此影响了正常睾丸的发育，这可能是隐睾发病机制之一，值得我们更进一步研究，为隐睾的分子治疗提供了新的方向。另外PCR检测结果示青春期和成年期隐睾组睾丸组织中ALDH1A1mRNA的表达量明显高于正常组睾丸组织，且蛋白质印迹和免疫组化结果与PCR一致。我们可以推测，青春期睾丸将开始处于发育成熟，产生精子阶段，成年期睾丸已经拥有正常产精功能，正常组青春期和成年期ALDH1A1的表达明显较幼年期减少，这可能暗示着RA较幼年期增多，参与促进生殖细胞的减数分裂，而与隐睾组青春期和成年期相比较，隐睾组ALDH1A1的表达量明显升高，由此，我们可能推测，表达量明显升高，可能暗示着RA的缺少，生殖细胞减数分裂减少，从而可能引起了隐睾患者的不育，这值得也我们更进一步的研究。另外，ALDH1A1作为肿瘤干细胞标志物的高表达于各种肿瘤疾病中，包括肝癌，肺癌，卵巢癌，食管癌，胃癌，前列腺癌，乳腺癌等[15]，由此我们可以推测，对于隐睾引起的另一并发症睾丸癌，是否也可应用ALDH1A1作为肿瘤干细胞标志物而进行诊断、治疗或预后分析，值得我们更进一步的深入研究。
