利用CT灌注成像评价瑞加德松对血脑屏障的开放程度。
2014年11月至2015年5月，30只新西兰大白兔随机分为实验组A1(瑞加德松1 ml/kg)、实验组A2(瑞加德松1.5 ml/kg，15 min内注完，分3次注入)和对照组B(与实验组A1相同体积的生理盐水)，后延迟30 min行CT灌注成像。测量并比较分析A1、A2、B三组的脑血流量(CBF)、脑血容积(CBV)、平均通过时间(MTT)及毛细血管表面通透性(PS)血流动力学参数值差异。三组内各选5只兔子扫描后注入2%伊文氏蓝，循环1 h后处死取脑，观察脑实质蓝染程度。
三组兔脑基底节区和皮质区灌注参数CBF、CBV值A1组[CBF：(89.88±2.21)、(81.42±4.28) ml·(100 g)－1·min－1；CBV：(3.97±0.43)、(3.66±0.16) ml/g]和A2组[CBF：(75.16±0.84)、(63.66±7.21) ml·(100 g)－1·min－1；CBV：(4.07±0.01)、(3.75±0.05) ml/g]分别明显高于B组[CBF：(20.08±5.08)、(14.58±8.62) ml·(100 g)－1·min－1；CBV：(0.85±0.04)、(0.65±0.17) ml/g]，差异均有统计学意义(均P<0.01)，脑组织蓝染明显，而A1组与A2组之间的CBV、CBF值无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。A2组的PS值[(22.43±8.09)、(20.20±7.01)ml·(100 g)－1·min－1]高于A1组[(13.82±4.44)、(10.12±2.44)ml·(100 g)－1·min－1]和B组(0.00、0.00)，B组最低，组间差异均有统计学意义(均P<0.01)。A1组[(2.50±0.82)、(2.47±0.10) s]与A2组、B组间MTT值差异无统计学意义，A2组[(4.50±0.17)、(4.72±0.15) s]的MTT值>B组[(1.88±0.09)、(1.99±0.00) s]，差异有统计学意义(P<0.05)。
CT灌注成像可监测瑞加德松导致血脑屏障开放的血流动力学改变，瑞加德松剂量的增加不仅引起CBV、CBF、PS值明显增大，且MTT延长，血脑屏障开放程度更大。
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中枢神经系统疾病难以治愈的一个重要原因是血脑屏障的屏蔽作用，生理状态下100%大分子药物和98%小分子药物[1,2,3]常难以通过血脑屏障发挥治疗作用。瑞加德松(regadenoson)是首个A2a腺苷受体激动剂，可通过激活A2a腺苷受体，促进冠状动脉舒张和增加冠状动脉血流量，在心肌灌注造影研究中显示其应用安全、有效[4,5]。2011年Carman等[6]对大鼠的实验研究表明腺苷受体激动剂可以增加血脑屏障的通透性，并且这种通透性的变化具有时间、剂量依赖性。因此，本研究旨在初步探讨瑞加德松对血脑屏障开放的可行性，并通过观察CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)参数值变化进行在体评价和监测，为进一步研究奠定基础。
2014年11月至2015年5月，选取成年健康新西兰大白兔30只(沈阳军区总医院动物实验中心提供)，实验动物使用许可证号：SCXK－(吉)CK2013－0003，不分雌雄，7月龄，平均体质量(3～4 kg)，随机分为三组，每组各10只，A1组注入瑞加德松1 ml/kg，A2组注入瑞加德松1.5 ml/kg，15 min内注完，分3次注入。B组为空白对照组，注入相同体积的生理盐水(1 ml/kg)。三组各自延迟30 min后开始CT灌注成像。
美国GE公司Light speed 128排螺旋CT；瑞加德松造影剂(140 μg·kg－1·min－1，上海佰世凯化学科技有限公司)；碘海醇注射液(100 ml∶35 g，北京北陆药业股份有限公司)；2%伊文氏蓝(Evans Blue，国药集团化学试剂有限公司)；水合氯醛溶液(10%∶5 ml，沈阳军区总医院)；GE公司AW4.5后处理工作站；双筒自动高压注射器(美国Medrad公司)；24 G×19 mm静脉留置针(上海锦泽夏木医疗器械有限公司)。
实验前兔子8 h禁食，自由饮水，所有实验兔均经腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)，观察其达到满意的麻醉状态后，由耳缘静脉放置24 G静脉留置针并妥善固定。将实验兔仰卧位固定于特制木板上后置于扫描床上，连接高压注射器与静脉留置针。术中根据情况适量追加麻醉剂及补充生理盐水。
(1)检查方法：先行兔脑冠状位普通扫描，层厚2.5 mm，选取视交叉(或基底节)层面为中心层面延伸至头尾两侧各1 cm，行2 cm范围内的脑灌注扫描。扫描参数：管电压120 kV，管电流110 mA，矩阵512×512，FOV 9.6 cm，层厚2.5 cm，共16层40 mm范围，扫描间隔时间为1 s，获得800幅灌注图像。使用高压注射器从耳缘静脉团注(0.5 ml/s)碘海酶造影剂(1.5 ml/kg)。扫描延迟5 s，连续50 s动态扫描，重建间隔0.5 s。(2)图像后处理：所有原始数据传到GE公司AW4.5后处理工作站，采用CT perfusion脑灌注软件包进行后处理，排除骨和空气的影响因素。手动选取基底动脉和上矢状窦分别为输入动脉、流出静脉，二者均为显示最佳层面。以2 mm2的ROI获得该区域的TIC曲线，经计算获得兔脑灌注伪彩图：脑血流量(cerebral blood flow，CBF)图、脑血容积(cerebral blood volume，CBV)图、平均通过时间(mean transit time，MTT)图和毛细血管表面通透性(permeability surface，PS)图。由1名测量者在不同时间同一功能图像上基底节区和皮质区内选取2个ROI，进行3次测定感兴趣区的血流动力学参数值(CBF、CBV、MTT和PS)，并求其平均值作为最终结果。
各组随机抽取5只兔脑在扫描结束后即刻注入2%的伊文氏蓝，循环1 h后左心室灌注处死取脑，进行脑组织冰冻切片，厚度为20 μm，并用荧光显微镜观察脑组织内荧光的亮度和荧光物质的分布特征。
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，三组间相同ROI区各参数值均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正方法，P<0.05为差异有统计学意义。
A1、A2组兔脑CBV、CBF图较B组呈现出明显的高灌注区，且高灌注区范围明显增大，A2组CBV、CBF图较A1组高灌注区范围增加；B组PS图无明显升高区，A1组PS图显示出散在升高区，A2组PS图呈弥漫性升高改变；B组、A1组、A2组三组MTT图所示延长区域明显依次增多(图1)。
三组兔脑基底节区和皮质区灌注参数CBF、CBV值A1组[CBF：(89.88±2.21)、(81.42±4.28) ml·(100 g)－1·min－1；CBV：(3.97±0.43)、(3.66±0.16) ml/g]和A2组[CBF：(75.16±0.84)、(63.66±7.21) ml·(100 g)－1·min－1；CBV：(4.07±0.01)、(3.75±0.05) ml/g]分别明显高于B组[CBF：(20.08±5.08)、(14.58±8.62) ml·(100 g)－1·min－1；CBV：(0.85±0.04)、(0.65±0.17) ml/g]，差异均有统计学意义(均P<0.01)，而A1组与A2组之间的CBV、CBF值无明显变化，差异均无统计学意义(均P>0.05)。三组间PS值[A1组：(13.82±4.44)、(10.12±2.44) ml·(100 g)－1·min－1，A2组：(22.43±8.09)、(20.20±7.01) ml·(100 g)－1·min－1，B组：(0.00、0.00)]差异均有统计学意义(均P<0.01)，A2组的PS值高于A1组和B组，B组最低。A1组[(2.50±0.82)、(2.47±0.10) s]与A2组[(4.50±0.17)、(4.72±0.15) s]、B组[(1.88±0.09)、(1.99±0.00) s]之间MTT值差异无统计学意义，但是A2组MTT值>B组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。
三组兔脑基底节及皮质脑灌注各参数值比较(n＝10)
三组兔脑基底节及皮质脑灌注各参数值比较(n＝10)
| 指标 | 基底节 | 皮质 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A1组 | A2组 | B组 | F值 | P值 | A1组 | A2组 | B组 | F值 | P值 | |
| CBF[ml·(100 g)－1· min－1] | 89.88± 2.21a | 75.16± 0.84a | 20.08± 5.08 | 102.6 | 0.002 | 81.42± 4.28a | 63.66± 7.21a | 14.58± 8.62 | 35.051 | 0.006 |
| CBV(ml/g) | 3.97± 0.43a | 4.07± 0.01a | 0.85± 0.04 | 71.29 | 0.003 | 3.66± 0.16a | 3.75± 0.05a | 0.65± 0.17 | 254.76 | 0.000 |
| MTT(s) | 2.50± 0.82 | 4.50± 0.17a | 1.88± 0.09 | 17.35 | 0.022 | 2.47± 0.10 | 4.72± 0.15a | 1.99± 0.00 | 596.86 | 0.000 |
| PS[ml·(100 g)－1· min－1] | 13.82± 4.44a | 22.43± 8.09a | 0.00 | 18.03 | 0.000 | 10.12± 2.44a | 20.20± 7.01a | 0.00 | 15.22 | 0.000 |
注：与B组比较aP<0.01；CBF.脑血流量，CBV.脑血容积，MTT.平均通过时间，PS.毛细血管表面通透性
A1组、A2组兔脑ROI可见明亮的红色荧光，神经细胞也可见鲜艳的红色荧光，而B组ROI未见确切的荧光，且A2组比A1组荧光颜色更深(图2)。
CTPI是一种用于评价组织器官微循环功能的成像方法，可通过测量PS值的大小反映肿瘤对血脑屏障的破坏程度[7]。以往评价瑞加德松开放血脑屏障的方法主要是监测荧光标记的右旋糖酐的含量或者渗入脑组织内化疗药物替莫唑胺的含量[8,9,10]，这些检测方法都具有创伤性且未实现在体监测。
本实验结果显示，A1组和A2组基底节区和皮质区的CBV、CBF值分别高于B组，这提示瑞加德松可以造成兔脑组织局部血流动力学发生改变，血管床容量升高，从而造成局部血流量升高；PS值反映的是毛细血管表面通透性大小的指标，本实验结果中A1组和A2组PS值均明显高于B组，这提示瑞加德松作为一种内源性嘌呤核苷酸受体激动剂致使对比剂经毛细血管内皮进入细胞间隙，客观反映出瑞加德松造成血脑屏障中的毛细血管内皮间隙增大，血脑屏障开放。A1组基底节区和皮质区CBF、CBV、MTT值与A2组之间无明显差异，而A2组PS值较A1组明显升高，说明A2组使血脑屏障的毛细血管内皮间隙增大较A1组明显，对比剂进入细胞间隙的速率增大，但血脑屏障的毛细血管储备能力可能已达到上限，致使血管床容量和局部血流量未见明显改变。同时瑞加德松剂量的增高，CBF、CBV灌注图显示出高灌注区域明显增多，PS图也从出现散在升高区到升高区弥漫分布，MTT图所示延长区域明显增多，但是MTT值虽有升高的趋势，但是差异无统计学意义，可能是局部毛细血管内皮细胞间隙增大，管腔处于松弛状态，同时由于血脑屏障开放的区域增多，血液重新分布，血液流经的路径增多，使得通过特定区域的平均时间有增加的趋势，但是这种改变尚不具有统计学意义，况且在诸多关于脑胶质瘤肿瘤血管CT灌注成像评价中MTT值由于血管的自动扩张导致很难准确测量，因此MTT值的价值有待深入探讨。A1组与A2组的灌注参数变化结果提示瑞加德松开放血脑屏障的程度与其剂量的叠加相关，剂量增大，开放程度随之增大，这可能是多剂量瑞加德松之间的药物协同作用引起的，这与Carman等[6]的研究结果相一致。另外，A2组较B组MTT值明显增大，差异有统计学意义，而A1组MTT值较B组有升高的趋势，但差异无统计学意义，且三组(B、A1、A2)中MTT灌注图所示延长区域的范围依次增加，提示瑞加德松剂量增大使血脑屏障明显开放，单位血管容积明显增加，平均通过时间延长，对血脑屏障的影响更大。
另外，瑞加德松注射液进入血液循环后使血脑屏障通透性增加的过程中伴随血流量的增加，且这种改变在脑组织的不同部位有所不同。A2a受体在中枢神经系统中分布密度最高的为脉络丛表面、嗅结节和纹状体，其次是脑膜、大脑皮质和海马[11]。从图1中4图可以看出血脑屏障开放的部位主要围绕脑室周围，血管走形区。同时，利用伊文氏蓝染色在荧光显微镜下观察，发现实验组脑组织脉络丛表面、嗅结节和纹状体，其次是脑膜、大脑皮质和海马区域被激发出明亮的红色荧光，对照组相应区域无明显的红色荧光物质，从而证实瑞加德松对血脑屏障的开放。
总之，CTPI可监测瑞加德松导致血脑屏障开放的血流动力学改变，为临床上促进治疗药物跨越血脑屏障进入脑组织提供一种在体定量无创检测的影像学方法。
