探讨P21活化激酶1(PAK1)在膀胱癌组织中的表达和其对膀胱癌细胞侵袭能力的生物学影响。
免疫组化法检测2009年1月至2012年12月在复旦大学附属金山医院手术获取的54份膀胱癌组织蜡块和12份正常膀胱组织蜡块中PAK1的表达情况，实时荧光定量PCR、Western印迹实验验证PAK1在膀胱癌细胞系和正常膀胱上皮细胞系中的表达差异。构建PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞稳定株，Transwell法检测PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞迁移及侵袭能力的改变。
PAK1在膀胱癌组织的表达明显高于正常膀胱上皮组织(28/54比1/12，P<0.05)，其高表达与高级别病理分级、淋巴转移以及肿瘤直径等呈正相关(均P<0.05)。膀胱癌细胞系T24、5637中PAK1的mRNA和蛋白水平明显高于正常膀胱上皮细胞系SV－HUC－1，PCR和Western印迹实验证实PAK1－短发夹RNA(shRNA)对膀胱癌5637细胞中PAK1表达抑制效果理想，迁移和侵袭实验证实PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞穿过小室数目较对照组减少。
膀胱癌组织中PAK1高表达是一个重要特征，与膀胱癌细胞迁移及侵袭能力有关，其调控的分子机制有待进一步深入研究。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
膀胱癌是国内泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率呈现增长趋势[1]。该疾病具有增殖及侵袭进展的特点，高侵袭性膀胱癌严重影响患者生活质量[2]。近年来分子生物学研究的发展为膀胱癌诊治提供了新思路，但仍没有完全明确其发生及进展的分子生物作用机制，寻找新的分子标志物对于膀胱癌的诊断和治疗具有重要意义。
小分子GTP酶如Ras、Rho、Rac、Cdc42等构建了一些恶性转化的信号通道，P21活化激酶(PAK)是Rac、Cdc42的作用底物，PAK由含有丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶组成，分为Ⅰ类PAK(包括PAK1、PAK2、PAK3)和Ⅱ类PAK(PAK4、PAK5、PAK6)[3]。PAK1属于PAK家族中的一员，最新研究显示其在部分肿瘤中存在高表达，可磷酸化肿瘤抑制因子(Merlin)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)，抑制活性而促进肿瘤的增殖和转移[4]。目前PAK1调控膀胱癌细胞增殖及侵袭迁移能力的分子作用机制尚不明确，本研究拟通过免疫组化观察其在膀胱癌组织中的表达情况；体外构建PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞稳定株，研究PAK1对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力影响，探讨PAK1在膀胱癌进展机制中的作用。
选取2009年1月至2012年12月间复旦大学附属金山医院的膀胱尿路上皮癌组织病理蜡块54份和正常膀胱上皮组织蜡块12份，收集临床资料。54例膀胱癌包括非肌层浸润(Ta～T1)39例、肌层浸润(>T1)15例；病理分级低级别29例、高级别25例，以上病理结果均经病理分析证实。研究方案经复旦大学附属金山医院伦理委员会批准(批准号：2014－14－01)。
人膀胱癌细胞系T24、5637和人正常膀胱上皮细胞系SV－HUC－1购自上海中科院细胞库。
PAK1基因干扰碱基序列和对照组无义碱基序列(siRNA)由上海吉玛公司负责设计合成。pHY－LV－KD5.1RNAi慢病毒载体由上海汉尹生物科技公司提供。
兔抗人PAK1多克隆抗体购自美国CST公司，辣根过氧化物酶标记鼠抗人β－肌动蛋白单克隆抗体购自上海康成生物公司，DAB显色试剂盒购自福建迈新公司，逆转录试剂盒购自大连Takara公司，TRIzol、lipo 2000、荧光定量PCR试剂盒均购自美国Life Technologies公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，ImageQuant LAS 4000化学发光图像成像系统购自美国通用电气公司。
蜡块组织切片，常规脱蜡、水化后行高压抗原修复，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，山羊血清封闭30 min，孵育一抗(1∶100)，4 ℃过夜，孵育二抗1 h，DAB显色，苏木精复染，常规脱水封片。双盲法观察染色结果，PAK1在胞质中表达，以出现黄色或棕褐色为阳性。5个高倍视野下计数阳性细胞数，染色范围：不显色为0分，细胞数<25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度：无染色为0分，弱阳性(浅黄色)为1分，中等阳性(黄色或棕色)为2分，强阳性(棕褐色)为3分。染色指数：为上述两种指数之和，0级为≤2分，1级为3～4分，2级为5～6分，3级为7分。定义：0级和1级为PAK1阴性，2级和3级为PAK1阳性。
TRIzol抽提细胞RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，PAK1引物序列：上游5'AGTTTCAGAAGATGAGGATGA－TGA，下游5'AATCACAGACCGTGTGTATACAG；内参基因GAPDH引物序列：上游5'CAGGAGGCATTG－CTGATGAT，下游5'GAAGGCTGGGGCTCATTT。采用20 μl反应体系，每个标本设置3复孔，运用Applied Biosystems 7 500 2.0.6版软件分析熔解及扩增曲线，采用2－ΔΔCt方法进行数据分析。
提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取35 μg蛋白上样，进行SDS－PAGE电泳，转膜，封闭，孵育一抗[PAK1(1∶1 000)、β肌动蛋白(1∶3 000)]，4 ℃过夜。加入二抗(1∶3 000)孵育1 h，TBST液轻摇清洗，ECL发光液显影，运用ImageQuant LAS4000 mini全自动化学发光图像成像系统采集信号并检测蛋白条带。
针对人PAK1基因干扰碱基序列和对照组无义碱基序列(siRNA)分别转染膀胱癌细胞5637，通过RT－PCR和Western印迹实验验证，确定PAK1基因干扰的靶点序列为GATGCTTTGACGCGGAATA，根据此序列合成1对寡聚单链DNA，插入短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体(均由上海汉尹生物科技公司提供)，通过转化，慢病毒重组质粒制备，包装，转染，收集，分装保存并检测滴度等步骤，感染膀胱癌5637细胞，通过RT－PCR和Western印迹实验验证shRNA对膀胱癌细胞5637 PAK1的沉默效率后，经过挑选克隆及药物筛选，扩大细胞培养，构建PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞稳定株。
将处于对数生长期的PAK1基因沉默的5637细胞稳定株和对照组细胞均分别接种到Transwell小室上室和经过Matrigel胶处理形成基质屏障胶的Transwell上室中，接种细胞数为20 000个细胞，并在下室中添加含20%胎牛血清的培养基600 μl，细胞培养24 h后，取出Transwell小室，拭去残余的上室细胞，固定染色后高倍镜视野下拍照并计数穿过小室的细胞数目，对数据进行统计分析。
实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验结果以
±s表示，两样本均数比较采用t检验，临床病理参数间比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
PAK1在膀胱癌组织染色主要在胞质部位，表现为黄褐色或棕褐色，54份膀胱癌组织中表达为阳性的有28份，阳性率为51.8%，12份正常膀胱上皮组织中PAK1染色，仅1份表达阳性，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。PAK1蛋白表达水平与病理分级、肿瘤直径、淋巴结转移相关(P<0.05)(表1)。
膀胱癌组织中P21活化激酶1(PAK1)的表达和临床病理资料的关系[例(%)]
膀胱癌组织中P21活化激酶1(PAK1)的表达和临床病理资料的关系[例(%)]
| 临床病理资料 | 例数 | PAK1 | P值 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | ||||
| 性别 | 0.872 | ||||
| 男 | 40 | 21 | 19 | ||
| 女 | 14 | 7 | 7 | ||
| 年龄(岁) | 0.291 | ||||
| ≤65 | 21 | 9 | 12 | ||
| >65 | 33 | 19 | 14 | ||
| 肿瘤直径(cm) | 0.007 | ||||
| ≤2 | 36 | 14 | 22 | ||
| >2 | 18 | 14 | 4 | ||
| 分级 | 0.006 | ||||
| 低级别 | 29 | 10 | 19 | ||
| 高级别 | 25 | 18 | 7 | ||
| 分期 | 0.050 | ||||
| ≤T1 | 39 | 17 | 22 | ||
| >T1 | 15 | 11 | 4 | ||
| 肿瘤数目 | 0.170 | ||||
| 1个 | 28 | 12 | 16 | ||
| >1个 | 26 | 16 | 10 | ||
| 淋巴转移 | 0.002 | ||||
| 是 | 12 | 11 | 1 | ||
| 否 | 42 | 17 | 25 | ||
| 复发 | 0.872 | ||||
| 是 | 40 | 21 | 19 | ||
| 否 | 14 | 7 | 7 | ||
实时荧光定量PCR实验显示膀胱癌细胞系5637和T24中PAK1的mRNA水平明显高于正常膀胱上皮细胞系SV－HUC－1(3.35±0.95、2.44±0.57比1.00)(P<0.05)。Western印迹实验显示3种细胞系均存在PAK1蛋白表达，膀胱癌细胞系5637、T24中PAK1蛋白条带明显高于正常膀胱上皮细胞系SV－HUC－1(图2)。
运用siRNA合成片段转染膀胱癌细胞5637，通过qPCR和Western印迹对siRNA片段沉默PAK1的效果进行分析，明确干扰效果最好的片段，确定干扰的靶点序列，通过慢病毒重组质粒制备及包装，成功构建慢病毒载体pHY－LV－KD5.1－PAK1－shRNA，结果显示PAK1－shRNA慢病毒液感染膀胱癌5637细胞的效率达95%以上(图3)。经过挑选克隆及筛选，扩大细胞培养，PCR实验显示PAK1基因沉默的5637细胞中的PAK1 mRNA水平较对照组明显降低(0.14±0.05比1.00)(P<0.05)，Western印迹实验显示干扰组细胞PAK1蛋白水平明显低于对照组(图4)，构建PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞稳定株成功。
与对照组比较，运用RNA干扰技术对PAK1干扰引起其表达水平下降，可导致膀胱癌5637细胞穿过滤膜的数目减少，表明存在其迁移和侵袭能力的降低，PAK1有助于膀胱癌细胞5637体外迁移及侵袭能力(图5)。
膀胱癌具有增殖及侵袭进展的特点，在肿瘤发展形成过程中，细胞核染色体及分子结构产生变化[5]，导致原癌基因激活、抑癌基因功能失活、相关信号通路关键蛋白活化、DNA修复基因突变[6]等而促进肿瘤的发生及进展转移。PAK1基因定位于11q13区，尽管其在肿瘤中一般并不发生突变，但它们在一些肿瘤中存在着过表达及过度活化，有研究表明口腔癌组织中存在PAK1高表达，降低PAK1表达可抑制细胞增殖，迁徙侵袭和促进细胞凋亡等生物学行为[7]，另有研究显示PAK1的表达与结肠癌病变的病理分级及临床分期存在相关性[8]，本实验结果显示PAK1在膀胱癌组织的阳性率显高于正常膀胱上皮组织，并且其表达水平与淋巴结转移、病理分级及肿瘤直径大小存在相关性，表明PAK1表达水平有助于判断病变，提示膀胱癌病变进展，有助于临床诊断。
我们运用人膀胱癌细胞系T24、5637和正常膀胱上皮细胞系SV－HUC－1行进一步研究，运用qPCR和Western印迹法检测膀胱癌细胞系5637、T24和正常膀胱上皮细胞系SV－HUC－1中PAK1的mRNA和蛋白水平的差异，结果显示在膀胱癌细胞系，PAK1的mRNA和蛋白水平均呈明显升高趋势，从细胞分子层面进一步验证了PAK1在肿瘤细胞中有高表达，可能与膀胱癌细胞的增殖、侵袭转移能力相关。
目前国内外对PAK1参与膀胱癌进展过程中的分子生物学机制研究尚不明确，为进一步了解PAK1如何参加膀胱癌细胞迁移及侵袭方面生物学行为，我们针对膀胱癌5637细胞的PAK1表达进行干预，成功构建PAK1基因沉默的5637细胞稳定株，通过实验发现PAK1－shRNA的5637细胞中PAK1的mRNA和蛋白水平出现明显降低，说明慢病毒介导的RNA干扰技术可以有效抑制膀胱癌细胞5637中PAK1的表达，为进一步研究PAK1在细胞中的所起到的生物学功能建立了一个研究平台。也有类似研究应用shRNA方法来抑制NIH3T3细胞中的内源性PAK1来观察其下游靶点蛋白的变化及对细胞增殖的影响[9]。肿瘤的侵袭转移是肿瘤病变发展进程的重要特点，我们针对PAK1是否参与调控膀胱癌细胞迁移和侵袭进行了Transwell实验，结果显示PAK1基因沉默的膀胱癌5637细胞穿过小室滤膜的细胞数目较对照组细胞数目明显减少，提示着下调PAK1的表达可以导致膀胱癌细胞5637的迁移和侵袭能力明显下降。有研究显示上调PAK1表达可以增强胃癌MKN45细胞的迁移能力，而抑制其表达可导致细胞侵袭能力减弱，并认为应激活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶等蛋白参与调节PAK1所介导的胃癌细胞迁移侵袭过程[10]，这与我们的研究结果有相似之处。
综上所述，PAK1在膀胱癌组织和细胞中存在高表达，并在膀胱癌细胞迁移和侵袭过程起重要作用，提示PAK1参与膀胱癌发生及进展过程，有助于膀胱癌诊断以及病情进展判断，是一个新的有潜在价值的肿瘤生物学标志物，PAK1异常高表达对膀胱癌的生物学影响及其具体参与细胞周期调控、侵袭转移的分子机制仍有待于进一步研究。
