观察正常及纤维化肺去细胞支架对人肺腺癌A549细胞α平滑肌肌动蛋白(α－SMA)表达的影响。
成年SD大鼠20只，按随机数字表法分为正常对照组与肺纤维化组各10只，肺纤维化组予博来霉素诱导建模，分别制备厚度为500 μm的正常去细胞与纤维化肺去细胞支架。根据A549细胞植入的支架不同分成正常支架组和纤维化支架组，单独培养的无支架A549细胞设为无支架对照组，各组分别体外培养1周，免疫荧光染色检测各组A549细胞α－SMA蛋白表达，实时荧光定量－PCR检测细胞α－SMA mRNA表达。
无支架对照组A549细胞α－SMA免疫荧光染色呈阳性表达，正常支架组与肺纤维化支架组免疫荧光染色呈弱阳性表达，其中肺纤维化支架组α－SMA免疫荧光强度显著低于正常支架组(P<0.05)；正常支架组、肺纤维化支架组α－SMA mRNA相对表达量均显著低于无支架对照组(0.70±0.11、0.55±0.12比1.28±0.21)，且肺纤维化支架组显著低于正常支架组(均P<0.05)。
正常及纤维化肺去细胞支架在体外可不同程度下调A549细胞α－SMA表达，其中纤维化肺去细胞支架作用尤为明显。
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肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度常由肿瘤细胞的侵袭和转移能力决定。研究表明，肿瘤细胞的扩散与细胞自身运动能力关系密切，其运动过程主要由肌动蛋白丝聚合形成的侵袭性伪足完成，可见肿瘤细胞的肌动蛋白表达在肿瘤转移过程中起着重要的作用[1]。目前，对肺癌的侵袭与转移机制研究主要集中在肿瘤细胞及细胞间信号传导通路方面[2,3]，而有关细胞外基质(ECM)微环境对肿瘤细胞生物学行为的调控作用报道甚少。近年来，研究发现正常生理状态下ECM不仅为细胞生长提供支架和附着位点，而且对细胞的黏附、迁移、分化及基因表达调控具有重要作用[4]。为此，本研究利用去细胞技术制备正常及纤维化肺ECM，观察两种不同肺去细胞支架对人肺腺癌细胞(A549)α平滑肌肌动蛋白(α－SMA)表达的影响，探讨不同的细胞生存微环境对肿瘤细胞生物学行为的调控作用，为今后从ECM角度寻找肿瘤细胞治疗靶点奠定实验基础。
SPF级成年雄性SD大鼠20只，体质量(290±20)g[购于温州医科大学动物实验中心。动物生产许可证号：SCXK(浙)2010－0044]。
十二烷基磺酸钠(SDS)、Triton－X100(美国Sigma公司)；注射用博来霉素粉剂(天津市太河制药有限公司)；青霉素－链霉素抗生素混合液(上海博蕴生物有限公司)；兔抗人α－SMA单克隆抗体(美国Abcam公司)；甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)小鼠单克隆抗体(上海康成生物工程有限公司)；DyLight 488标记的山羊抗兔IgG二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG抗体(美国EarthOx公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物有限公司)；DNA检测试剂盒(美国Omega公司)；低糖型DMEM培养基(美国Gibco公司)；A549细胞(中科院上海细胞所)。
参考文献[5]，20只大鼠按随机数字表法分为正常对照组与肺纤维化组各10只。肺纤维化组予博来霉素溶液气管内缓慢注入，给药剂量为5 mg/kg，给药后迅速直立大鼠旋转5 min，使药物均匀分布在两肺组织；正常对照组予气管内缓慢注入等容积的生理盐水。两组动物均在气管内灌药后4周处死，取左下肺叶部分组织匀浆测羟脯氨酸含量，并行组织HE、Masson染色，观察大鼠肺组织病理学变化，采用Szapiel等[6]的标准评估肺纤维程度：无间质纤维化(0分)；轻度间质纤维化(1分)，病变范围<20%；中度肺间质纤维化(2分)，病变范围在20%～<50%；重度肺间质纤维化(3分)，病变范围≥50%，肺实质结构紊乱。
两组大鼠肺去细胞支架的制备采用课题组先前文献报道方法[6,7]。实验大鼠获取新鲜全肺和心脏前，先经下腔静脉注射2 ml肝素致全身肝素化。切取的心肺联合体经肺主动脉灌注肝素磷酸盐缓冲溶液(PBS)，冲洗肺脏残留血液至肺呈土黄色。采用TritonX－100、SDS灌注法，先用1%的TirtonX－100共500 ml灌注，再用0.8%的SDS 2 000 ml灌注，最后去离子水500 ml灌注，灌注液流速匀速控制在8 ml/min，灌注全程恒温37 ℃，灌注压波动在8～30 cmH2O(1 cmH2O＝0.098 kPa)。将制备的肺去细胞支架用无菌PBS冲洗干净，置于4 ℃含抗生素PBS保存备用。倒置显微镜观察正常及纤维化肺去细胞支架形态改变，HE染色观察两组肺去细胞支架有无残留细胞及细胞核等结构，并取部分正常肺组织与两组肺去细胞支架(正常及纤维化)，分光光度法分别检测各组标本DNA浓度(参照DNA试剂盒说明操作)。同时计算各组标本A260/A280比值(A260、A280分别代表核酸及蛋白质的吸光度)，以此表示各组标本DNA纯度。
A549细胞株解冻后加完全培养基(10%胎牛血清＋0.5%双抗＋高糖DMEM)，调整细胞密度为2×106/ml，静置于37 ℃，5%CO2培养箱内，6 h、24 h分别更换培养基，连续培养72 h后可进行传代。细胞培养实验分3组：无支架对照组、正常支架组及纤维化支架组。所有去细胞支架分别切成大小约400 mm×400 mm，厚度为500 μm。取浓度为1×107/ml的A549细胞悬液10 μl分别滴入正常及肺纤维化支架切片中，30 min后将去细胞支架切片转移到独立的6孔板中，沿壁加入培养，单独A549细胞培养(无支架)设为无支架对照组。各组细胞在37 ℃，5%CO2培养箱中培养1周，每组实验重复6次。
各组A549细胞4%多聚甲醛固定，0.5%的Trition X－100破膜后PBS冲洗3次，再血清封闭1 h，弃血清后分别加入α－SMA单克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜后室温静置1 h，PBS冲洗干净，分别加入DyLight 488标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶200)，室温避光孵育2 h，PBS冲洗3次，加入DAPI染色10 min，PBS冲洗干净后甘油封片，Nikon荧光显微镜观察细胞并拍照，结果用图像分析软件(Image J)分析。
按试剂盒说明书提取细胞总RNA，转录成cDNA后进行PCR检测。引物设计根据NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/31906055)中人α－SMA基因序列，以Primer 5.0在线软件设计特异性引物。α－SMA引物：上游5′GGCCGAGATCTCACTGACTAC 3′，下游5′TTCATG GATGCCAGCAGA 3′；GAPDH引物：上游5′GGTGAA GGTCGGAGTCAACG 3′，下游5′CAAAGTTGTCAT GGATGACC 3′。反应条件：94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环。反应结束后，记录每个样品中的荧光强度增加到荧光阈值所对应的扩增循环数(Ct值)。以管家基因GAPDH为内参照，计算目的基因mRNA的相对表达量。
实验数据采用SPSS 20.0统计软件分析处理，正态分布的计量资料用
±s表示，组间参数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
肺纤维化组羟脯氨酸含量为(1.516±0.339)μg/mg，显著高于正常对照组的(0.543±0.194)μg/mg(P<0.05)。正常对照组肺组织结构完整、清晰，无异常病理改变(图1A)；肺纤维化组局部肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，组织胶原纤维增生较明显(图1B)。Masson染色显示肺纤维化组蓝色的胶原纤维较正常对照组明显增多，肺间质明显增厚(图1C，图1D)。两组大鼠肺纤维化评分分布情况见表1。
两组大鼠肺纤维化评分分布情况(只)
两组大鼠肺纤维化评分分布情况(只)
| 组别 | 只数 | 0分 | 1分 | 2分 | 3分 |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | 9 | 1 | 0 | 0 |
| 肺纤维化组 | 10 | 0 | 0 | 0 | 10 |
HE染色显示正常和纤维化肺组织去细胞后，肺支架呈"蜂窝状"结构，正常支架组与纤维化支架组去细胞支架上均未见明显残留细胞及细胞核结构(图2)。基因组DNA浓度分析显示两组去细胞肺支架DNA浓度均显著低于正常对照组未去细胞的肺组织(P<0.01)，各组提取的DNA标本A260/A280比值在1.8～2.0，表明标本DNA纯度较高(表2)。
各组肺组织DNA含量测定(n＝10，
±s)
各组肺组织DNA含量测定(n＝10，±s)
| 组别 | DNA含量(ng/mg干重) | A260值 | A280值 | A260/A280值 |
|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 794.7±86.6 | 19.236±1.761 | 10.257±1.087 | 1.879±0.057 |
| 正常支架组 | 42.5±4.4a | 0.310±0.039 | 0.166±0.019 | 1.865±0.053 |
| 纤维化支架组 | 45.7±5.9a | 0.320±0.041 | 0.171±0.020 | 1.870±0.050 |
注：A260、A280分别代表核酸及蛋白质的吸光度；与正常对照组比较，aP<0.05
免疫荧光染色法测定显示：无支架对照组A549细胞α－SMA表达呈阳性，正常支架组与纤维化支架组A549细胞α－SMA表达均不明显，呈弱阳性；正常支架组与纤维化支架组A549细胞α－SMA蛋白荧光表达均显著低于无支架对照组(均P<0.05)，其中纤维化支架组显著低于正常支架组(P<0.05)；正常支架组与纤维化支架组细胞α－SMA的mRNA表达均显著低于无支架对照组(均P<0.05)，其中纤维化支架组显著低于正常支架组(P<0.05)(图3，表3)。
各组A549细胞α－SMA蛋白及其mRNA的相对表达量(n＝6，
±s)
各组A549细胞α－SMA蛋白及其mRNA的相对表达量(n＝6，±s)
| 组别 | α－SMA蛋白(×10－3)a | α－SMA mRNA |
|---|---|---|
| 无支架对照组 | 69.5±5.8 | 1.28±0.21 |
| 正常支架组 | 41.8±0.9a | 0.70±0.11a |
| 纤维化支架组 | 35.5±1.7ab | 0.55±0.12ab |
注：α－SMA：α平滑肌肌动蛋白；a为免疫荧光强度值；与无支架对照组比较，aP<0.05；与正常支架组比较，bP<0.05
本研究利用博来霉素气管滴注制备大鼠肺纤维化模型，结果显示给药4周后大鼠肺组织羟脯氨酸含量明显升高。羟脯氨酸是合成胶原蛋白的一种特有氨基酸，其组织含量的测定是研究胶原代谢的重要方法。组织器官纤维化时细胞外基质的主要成分胶原蛋白会明显增生。因此，通过羟脯氨酸含量测定可反映组织器官纤维化的严重程度[8]。结合HE、Masson染色等肺组织病理学研究结果，给药4周后肺纤维化组大鼠肺纤维评分显著高于正常对照组，表明肺纤维化模型制作成功。
传统的肿瘤细胞生物学研究通常采用普通二维平面培养，这种方法忽略了机体细胞所处的三维空间结构对其自身运动、分化等生物学行为的影响[7,9]。为此，有研究人员采用人工聚合水凝胶支架技术[10]，用于评估细胞与ECM的相互作用，但这些合成的生物材料往往仅为单一的ECM蛋白，缺乏天然ECM复杂的蛋白质组分，难以真实模拟组织细胞生存的ECM微环境。近年来，随着组织器官去细胞技术的迅速发展，利用天然生物组织制备去除细胞的ECM成为可能[11,12]。理想的去细胞生物支架除保留传统的ECM结构与成分，需尽可能清除含DNA的核酸成分[13]，使去细胞支架DNA含量<50 ng/mg，以防止移植后出现免疫排斥反应[14]。本研究制备的正常与纤维化肺去细胞支架DNA浓度均小于该标准，且两种去细胞支架的HE染色均未见明显细胞核结构，提示所制备的两种去细胞生物支架可避免细胞再种植后的免疫排斥反应，是一种较理想的天然ECM。
ECM主要由Ⅰ型胶原、弹性蛋白，层黏连蛋白和Ⅳ型胶原等组成，长期以来被简单的认为是细胞生存的三维空间结构。近年来，研究发现ECM不仅是包裹细胞的生物支架，而且在调控细胞生理及病理过程中均起着重要的作用[15,16]，其介导的细胞生物学功能研究备受关注。越来越多研究表明，细胞生物学行为常因其所处ECM环境不同而异，不同的ECM可通过特殊的三维空间结构及其所结合各种细胞生长因子，为细胞传递生物信号，调节细胞运动、分化等生物学行为[7,17,18,19]，可见ECM是一种重要的健康和疾病"调节器"。本研究为了更好地在体外观察ECM对肺肿瘤细胞A549的生物学行为影响，我们采用化学去污剂灌注法去细胞技术制备出正常及纤维化肺去细胞支架，并将其与A549细胞体外共培养。相比传统的A549细胞体外单独培养，两种不同去细胞支架均可有不同程度下调A549细胞α－SMA蛋白和基因表达作用，其中以纤维化支架作用较为显著，而α－SMA表达下降被认为可能导致肿瘤细胞自身运动、侵袭能力的减弱[20]。提示两种去除细胞后的肺ECM有不同程度抑制A549细胞运动的作用，且以纤维化肺ECM对其抑制作用最为明显。其作用机制可能与两种支架特殊的空间构象及差异蛋白质组分有关[19]，但具体机制尚不明确，有待今后进一步深入研究。
综上所述，本研究通过观察两种不同肺去细胞支架对A549细胞自身运动相关蛋白α－SMA表达的影响，初步揭示了两种不同ECM微环境对A549细胞运动能力的调节作用，也为今后从ECM角度寻找肺癌临床治疗靶点提供了研究思路。
