探讨赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1, LSD1)对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响及其机制。
利用RNAi技术和单胺氧化酶抑制剂(Pargyline)在体外抑制结肠癌细胞(SW620)中LSD1的表达，采用MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验、FCM细胞凋亡实验检测抑制LSD1的表达对结肠癌细胞SW620增殖、侵袭、凋亡的影响。
体外合成了三段siRNA序列(siRNA-1554、siRNA-705、siRNA-1973)，经检测siRNA-705的沉默效率最高。利用siRNA-705和单胺氧化酶抑制剂体外干预SW620细胞，能明显抑制SW620细胞的增殖、侵袭和转移能力，并能诱导细胞凋亡。同时我们发现，使用siRNA-705和单胺氧化酶抑制剂处理72 h后，结肠癌细胞的E钙黏蛋白的表达水平明显上调，N钙黏蛋白的表达水平明显下调(P<0.05)。
体外抑制LSD1的表达能抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭转移能力，诱导细胞凋亡，并能上调E钙黏蛋白的表达，下调N钙黏蛋白的表达，三者可能在结肠癌的侵袭转移过程中发挥了重要作用。
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结肠癌的发病率整体呈上升趋势，是第三常见的恶性肿瘤，死亡率第四位，转移是导致结肠癌患者死亡的主要原因[1]。目前普遍认为，上皮间质转化(EMT)在癌症转移的起始中发挥重要作用，在此过程中，上皮细胞获得成纤维细胞样特性，细胞极性消失，细胞间黏附作用减退，侵袭和运动能力增强。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)在转录因子Snail/Slug介导的上皮间质转化过程中不可或缺，没有LSD1的参与，Snail将不能有效抑制E钙黏蛋白的表达[2]。LSD1是第一个被发现的组蛋白特异性去甲基化酶，过表达LSD1能促进多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[3,4]，但其是否与结肠癌的转移相关尚待检验。本研究利用RNAi技术和单胺氧化酶抑制剂(Pargyline)在体外抑制结肠癌细胞(SW620)中LSD1的表达，采用MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验、FCM细胞凋亡实验检测抑制LSD1的表达对结肠癌细胞SW620增殖、侵袭、凋亡的影响。
结肠癌细胞SW620细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)。LSD1、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH兔抗人单克隆抗体购自美国R&D公司，Pargyline购自美国Epigentek公司，HRP标记的羊抗兔IgG购于美国SANTA CRUZ公司，LSDl、E-cadherin、N-cadherin基因，内参照GAPDH引物由上海吉玛生物公司合成。
在GenBank中检索出人源LSD1序列(NM_001009999.2)，其FASTA格式序列为：>gi|226437585|ref|NM_001009999.2| Homo sapiens lysine (K)-specific demethylase 1A (KDM1A), transcript variant 1，mRNA。按照siRNA设计原则，设计siRNA序列(表1)。
siRNA引物序列
siRNA引物序列
| 序号 | 代码 | 序列 |
|---|---|---|
| 1 | LSD1-homo-1554 | 正义链5′ GCCACCCAGAG AUAUUACUTT 3′ |
| 反义链5′ AGUAAUAUCUC UGGGUGGCTT 3′ | ||
| 2 | LSD1-homo-705 | 正义链5′ CCGGAUGACU UCUCAAGAATT 3′ |
| 反义链5′ UUCUUGAGAAG UCAUCCGGTT 3′ | ||
| 3 | LSD1-homo-1973 | 正义链5′ CCACGAGUCA AACCUUUAUTT 3′ |
| 反义链5′ AUAAAGGUUU GACUCGUGGTT 3′ | ||
| 4 | LSD1 negative | 正义链5′ UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT 3′ |
| 反义链5′ ACGUGACACG UUCGGAGAATT 3′ |
将以上Target sequence交给上海吉玛制药技术有限公司，构建成LSD1基因的siRNA表达载体(PGCsi3.0-LSD1-siRNA)，并构建Control siRNA作为阴性对照。质粒制备完成后进行细胞转染。
Transwell小室的PVPF膜上预先铺上基质胶，于37 ℃放置2 h，室温过夜后在Transwell下室加入1 ml RPMI1640培养基[(含10%胎牛血清(FBS)]，取2 ml细胞悬液加入到Transwell的上室。取出Transwell趋化板，将其置于37 ℃的CO2孵育箱中孵育。12 h后取出PVPF膜，擦去基质胶和Transwell上室内的细胞，用95%乙醇固定Transwell下室内的细胞约30 min，结晶紫染色20 min。随机选取10个视野，于倒置相差显微镜下(10×20)观察、计数并照相。
将细胞培基吸至离心管内，胰酶消化，用PBS缓冲液冲洗贴壁细胞，使细胞重悬浮。使用Binding缓冲液将细胞稀释至106/ml。取100 μl已重悬浮的细胞(105个细胞)至5 ml的培养管，加入195 μl膜连蛋白-异硫氢酸荧光素结合液并轻摇，使细胞重新悬浮。加入5 μl膜连蛋白-异硫氢酸荧光素，轻摇使其充分混匀。20 ℃铝箔纸遮光孵育15 min。800 g离心约5 min，弃上清，加入180 μl膜连蛋白-异硫氢酸荧光素结合液，轻摇使细胞重新悬浮。加入2 μl PI染色液轻摇混匀，冰浴后箔纸遮光放置。预备好待测样品后尽快(1 h)进行流式细胞仪检测。
使用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间均数差异的比较采用ANOVA分析(单因素方差分析)或者Student-t检验的方法，方差齐时两两比较采用SNK检验，方差不齐时采用Dunnett′C检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
PGCsi3.0含有绿色荧光蛋白(GFP)编码基因，有助于检测细胞转染的效率。利用Lipo 2000将PGCsi3.0-LSD1-siRNA转染结肠癌SW620细胞，48 h后于倒置荧光显微镜下观测，转染效率在80%以上(图1)，适于进行后续的RNAi干扰实验。
A：一般光源下的SW620细胞；B：荧光源下的SW620细胞
转染LSD1-siRNA质粒对结肠癌SW620细胞中LSD1 mRNA及蛋白表达的影响：实验组与NC-siRNA组、空白组中LSD1 mRNA和LSD1蛋白的差异有统计学意义(分别为F＝8.61，P<0.05；F＝27.69，P<0.05和F＝491.20，P<0.05；F＝782.3，P<0.05)，实验组LSD1 mRNA及蛋白的表达水平明显低于NC-siRNA组和空白对照组(图2，图3)。实验组中以siRNA-705组的LSD1 mRNA及蛋白的表达水平最低(分别为F＝22.00，P<0.05和F＝115.7，P<0.05)，而NC-siRNA组和空白对照组之间差异无统计学意义(t＝－0.139，P>0.05；t＝0.12，P>0.05)。以上实验提示siRNA-705对LSD1基因的沉默效率最高，故采用siRNA-705进行后续实验。
1：空白对照组；2：NC-siRNA；3：siLSD#1；4：siLSD#2；5：siLSD#3
1：空白对照组；2：NC-siRNA；3：siLSD#1；4：siLSD#2；5：siLSD#3
不同浓度的Pargyline干预前(0 h)，各组SW620细胞的增殖活性差异无统计学意义(F＝0.52, P>0.05)。在24、48、72 h 3个时间节点，各组SW620细胞的增殖活性差异有统计学意义(依次F＝24.71, P<0.05;F＝74.86, P<0.05;F＝174.39, P<0.05)。2.5、5.0和10.0 mmol/L浓度的Pargyline对SW620细胞生长的抑制效果明显高于0.5、1.0 mmol/L浓度组和对照组(P<0.05)，而2.5、5.0和10.0 mmol/L浓度的Pargyline之间，以及0.5、1.0 mmol/L浓度的Pargyline和对照组之间SW620细胞的增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)。因此，我们选择2.5 mmol/L的Pargyline进行后续实验(图4)。
LSD1-siRNA、Pargyline能使SW620细胞的增殖能力明显下降，且对细胞增殖的抑制作用呈时间依赖性。在24、48、72 h 3个时间节点，与对照组相比，siRNA组和Pargyline组中SW620细胞的增殖活性都明显降低(依次F＝166.68, P<0.05;F＝137.76, P<0.05;F＝294.80, P<0.05)。但在24、48、72 h 3个时间节点，siRNA组与Pargyline组的细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)，空载体组与阴性对照组的细胞增殖活性差异亦无统计学意义(P>0.05)(图5)。
siRNA组和Pargyline组的SW620细胞侵袭性明显低于空载体组和阴性对照组(F＝100.41, P<0.05)，siRNA组和Pargyline组的SW620细胞侵袭性差异无统计学意义(t＝－0.232, P>0.05)，空载体组和阴性对照组细胞侵袭性差异无统计学意义(t＝0.702, P>0.05)(图6)。
A：对照组；B：siRNA组；C：Pargyline组；D：空载体组
siRNA组和Pargyline组SW620细胞的凋亡率明显高于空载体组和阴性对照组(F＝260.23, P<0.05)，而siRNA组和Pargyline组的SW620细胞凋亡率差异无统计学意义(t＝2.68, P>0.05)，空载体组和阴性对照组细胞凋亡率差异无统计学意义(t＝－0.10, P>0.05)(图7)。
A：对照组；B：siRNA组；C：Pargyline组；D：空载体组
LSD1-siRNA、Pargyline对SW620细胞中LSD1、E-cadherin、N-cadherin mRNA、蛋白表达的影响：(1)siRNA组和Pargyline组的LSD1、N-cadherin的蛋白水平较空载体组和阴性对照组明显下调(分别F＝618.98, P<0.05；F＝114.60, P<0.05)，E-cadherin的蛋白水平较空载体组和阴性对照组明显上调(F＝800.81, P<0.05)(图8)。(2) siRNA组和Pargyline组的LSD1、N-cadherin mRNA水平较空载体组和阴性对照组明显下调(分别F＝173.85, P<0.05；F＝209.69, P<0.05)，E-cadherin mRNA水平较空载体组和阴性对照组明显上调(F＝245.85, P<0.05)。
1：对照组；2：siRNA；3：Pargyline；4：空载体组
组蛋白(histones)是真核细胞染色质中的主要蛋白组分。组蛋白修饰通过改变组蛋白与DNA之间的动力学关系而影响染色质构象，从而激活或阻断基因的转录与翻译，在肿瘤的发生、增殖、侵袭转移中发挥重要作用。组蛋白修饰可作为一种标志或语言，有人提出了"组蛋白密码"的假说[5],组蛋白修饰已经成为表观遗传学的重要组成部分。
我们在前期研究中发现LSD1的表达在组织和细胞水平与结肠的侵袭转移能力呈正相关，阳性表达LSD1、阴性表达E钙黏蛋白的结肠癌患者往往预示着更差的预后[6]。在本部分实验中，我们发现抑制LSD1的表达能在体外有效抑制结肠癌细胞的增殖、转移，诱导结肠癌细胞凋亡。
无序增殖是恶性肿瘤的重要生物学特征。已经在多种恶性肿瘤中证实，LSD1可以促进肿瘤细胞的无序增殖，并可成为评估预后的分子生物标记，高表达往往预示着更低的5年总体生存率。LSD1对于维持细胞的增殖必不可少，LSD1能促进细胞周期时相的转变，从而促进肿瘤细胞的增殖[7]。并非所有细胞的增殖都受到LSD1的调控，LSD1仅对具有多向分化潜能的肿瘤细胞促进增殖的作用明显，而对不具有多向潜能的正常体细胞的作用效果微弱[8]。
与其他上皮源性的恶性肿瘤一样，结肠癌的转移也与上皮间质转化有关。包括Snail、Slug等在内的锌指蛋白家族在上皮间质转化过程中发挥重要作用，其能通过"钙黏蛋白转换(Cadherin switching)"使肿瘤细胞更富于侵袭转移性[9,10,11]，通过"侵袭-转移级联反应"形成远处转移灶。Snail能直接抑制E-cadherin的表达而促进EMT的发生，促进肿瘤转移，但EMT过程中的潜在表观遗传调节机制尚不清楚。研究显示[2,12]，Snail与LSD1-CoREST复合物结合并将LSD1招募至E-cadherin基因的启动子区域，使该区域二甲基化的组蛋白3第4位赖氨酸(H3K4m2)去甲基化，从而抑制E-cadherin的表达。在缺乏LSD1的情况下，E-cadherin启动子区域的H3K4m2水平明显增高，Snail对E-cadherin的抑制将部分被逆转，甚至失去抑制作用。这提示在EMT过程中，LSD1的存在对于Snail介导的基因转录抑制是必不可少的，LSD1有望成为阻止肿瘤转移的治疗靶点。
但Snail是如何与LSD1-CoREST复合物相互作用的，与E-cadherin启动子区域结合的是Snail还是LSD1-CoREST复合物？Lin等[2]的研究显示，Snail的SNAG结构域和LSD1的胺氧化酶结构域对二者的相互作用必不可少。Lin等推测SNAG结构域类似于组蛋白H3样的结构，能扮演"分子挂钩"的角色与LSD1-CoREST复合物相互作用，形成Snail1-LSD1-CoREST三元络合物，该络合物对上述蛋白的功能和稳定性非常重要，避免被酶降解。Snail通过其锌指结构将该络合物与靶基因启动子的E-box序列结合，抑制靶基因的表达。
我们的研究发现：在LSD1-siRNA和Pargyline(抑制LSD1的酶活性)干预SW620细胞72 h后，SW620细胞的内LSD1、N-cadherin的表达水平明显下调，而E-cadherin的水平明显上调，细胞的侵袭性降低。我们推测：LSD1能通过其组蛋白特异性去甲基化酶的活性，下调E-cadherin启动子区域组蛋白H3K4的甲基化水平，利用表观遗传修饰途径调节靶基因的转录和翻译，最终影响结肠癌侵袭和转移。因此，我们拟更加深入地开展LSD1影响结肠癌转移机制的研究。
综上所述，LSD1-siRNA和单胺氧化酶抑制剂Pargyline能在体外有效抑制LSD1的表达，并能抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭转移，诱导细胞凋亡。LSD1可能通过下调E钙黏蛋白启动子区域H3K4m2水平的途径抑制E钙黏蛋白的转录，并有可能成为阻止结肠癌转移的新的分子靶点，这些都有待于体外细胞实验和动物实验的进一步证实。
