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随着育龄人群不孕不育率逐渐升高(约12.5%～15%)，辅助生殖技术(ART)已成为解决该问题的首选临床手段，同时也面临诸多问题如胚胎着床率及活体出生率偏低(分别为50%和35%左右)、先天缺陷率偏高(0.5%～1%)、糖代谢异常、DNA甲基化模式改变和印迹基因(如H19)的表达改变等[1]。胚胎对体外培养环境要求非常严格，O2浓度、氨基酸成分、矿物油覆盖、培养体积、培养密度、温度、湿度、pH值、人工显微操作压力等均有可能造成胚胎发育异常，其中光照也是重要影响因素之一[2]。自然状态下女性生殖及胚胎生长发育处于完全避光的环境，而ART手段使配子和胚胎暴露于各种波长和强度的光源中：显微镜光源、室内照明灯光及室外光线的射入，其中显微镜光照的影响最为严重[3]。研究和明确光照对早期胚胎发育的影响在保证胚胎安全和后代健康方面有着极为重要的意义和价值，本文将从以下几个方面进行综述和探讨。
哺乳动物胚胎对光线高度敏感。除了色素细胞、视杆细胞和视锥细胞等感光细胞外，胚胎细胞等非感光细胞因具有核黄素结构物质、氧化酶类、线粒体细胞色素系统、血红素结构域蛋白、色氨酸、酪氨酸等吸光性生物大分子，也会对光照产生反应。配子及胚胎经光照后会对其发育产生不利的影响(表1)。Li等[4]通过对猪孤雌激活胚进行单因素光照实验发现环境光可造成胚胎成囊率及胚胎质量的显著下降，因此有必要进行暗中操作。也有其他研究者认为，环境光可造成胚胎发育质量的下降但不同物种之间具有差异，Takenaka等[5]认为仓鼠卵子及胚胎是对可见光极端敏感的物种之一，其发育所受光照影响最为严重，相反兔子的胚胎则几乎不受影响。Ottosen等[3]认为在体外操作过程中环境光虽然存在，但胚胎所接触的光源95%来自于显微镜，仅暗室操作是不够的，同时也应通过照度计等光照测量工具对显微镜光照剂量加以控制从而保证胚胎的安全。Korhonen等[6]发现在显微镜上添加绿色可见滤波片(498～563 nm)和不加滤波片胚胎形态没有明显差异，但无滤波片组细胞内热休克蛋白HSP70的mRNA水平明显升高。因此，无论是进行黑暗操作还是对显微镜光源进行控制，对提高胚胎质量保证出生儿的健康来说都是有必要的[7]。胚胎体外显微操作中需离开恒温、恒湿、保持5% CO2浓度的培养箱置于显微镜下，Zhang等[8]认为该过程导致胚胎培养微环境的改变如CO2改变导致pH值短暂上升，温度的波动等，但同时也存在显微镜可见光对胚胎的应激作用。目前大多数胚胎光照实验基本上采用类似恒温箱的透明塑料或玻璃装备保证体外光照实验过程中温度、湿度、O2浓度、CO2浓度等与黑暗培养箱保持一致，从而将光照以外其他因素的影响尽可能减小[9]。
光照对哺乳动物胚胎发育的影响
光照对哺乳动物胚胎发育的影响
| 物种 | 胚胎时期 | 光源类型 | 光照波长(nm) | 光照剂量 | 光照时间 | 光照结果 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 仓鼠[10] | 合子期 | 40 W荧光灯 | 380～780 | 400 lux | 30 min | 胚胎细胞DNA大量损伤，与254 nm紫外光造成的细胞损伤相一致 |
| 仓鼠[11] | 2－细胞 | － | 445～500620～750 | 200/900 lux | － | 200 lux剂量可见光照下，桑葚胚和囊胚的胚胎数量比900 lux增加。蓝光照射下，比红光形成囊胚数量少，且热休克蛋白Hsp70及ROS水平增高，胚胎出现凋亡现象 |
| 小鼠[5] | 合子期 | 40 W冷白色荧光灯、暖白色荧光灯 | 400～750380～750 | 1 200 lux | 15～30 min | 胚胎细胞内ROS升高，随照射时间增加，细胞凋亡率增加 |
| 小鼠[12] | 2－细胞 | 30 W卤素灯 | 偏冷光可见光 | 1 600 lux | 30 min | 胚胎发育率降低 |
| 小鼠[13] | 2－细胞 | 30 W卤素灯 | 可见光 | 1 600 lux | 30 min | 无光线照射组胚胎孵化、附着能力等生长发育能力高于有光线照射组胚胎 |
| 家兔[14] | 合子期/2－细胞 | 飞利浦8 W氖管灯 | 320～740 | 1 600 lux | 8 h/20 h | 光照8 h胚胎核型发生改变，细胞质电子密度增加；光照20 h囊胚发育率大幅度下降且出现细胞器中央集聚、细胞表面分化功能缺失 |
| 牛[6] | 配子及合子 | 飞利浦15 W卤素灯 | 400～1 000 | 7.130 W/m2 | 3 h | 胚胎细胞产生应激反应，诱导大量热休克蛋白Hsp72生成 |
光照对胚胎造成的损伤主要表现在以下几个方面：DNA损伤、活性氧(ROS)生成、线粒体功能的紊乱、电子呼吸链损伤、应激反应(如Hsp70家族蛋白表达升高)和诱导性凋亡等[15,16]。首先，紫外线(UV)或<750 nm波长的可见光含有高能的UV射线，其波长与DNA的吸收峰(260 nm)相近，极易被DNA吸收造成基因突变、断裂。其次，光线可诱导ROS的生成，导致体外胚胎氧化压力显著高于体内胚胎，影响胚胎质量[17]。可见光照射下，胚胎细胞中的分子吸收不同波长光子后生成O2-、H2O2、OH－等ROS。ROS对细胞具有毒性作用，造成胞质钙离子浓度升高、胞膜去极化、细胞器损伤、DNA合成受阻以及细胞凋亡[18]。ART中的配子及胚胎细胞氧化压力过大会造成细胞内不饱和脂肪酸、甾醇类物质的氧化，甘油醛－3－磷酸脱氢酶失活等生物大分子损伤，导致细胞器等亚细胞功能结构紊乱，最终影响胚胎质量[19]。此外，ROS会导致胚胎细胞线粒体结构的严重破坏，线粒体内存在细胞色素、黄素蛋白、NAD(P)H等高密度物质，对可见光及UV有强烈的吸收作用，可产生ROS或导致多聚ADP核糖聚合酶PARP、凋亡诱导因子AIF的激活[20]。由于过氧化物酶具有黄素结构，光线照射后可引发光致还原反应产生H2O2，使线粒体被攻击。光线照射诱发的ROS可破坏线粒体结构以及电子呼吸链导致细胞损伤，或通过激活AIF引发细胞凋亡。因此IVF过程中减少胚胎细胞ROS的含量可减缓DNA断裂及胚胎凋亡[21]。然而，也有研究者指出在1.48 μmol/L激光照射下胚胎细胞可通过热休克蛋白HSP70i家族启动自身的保护机制，降低胚胎凋亡[22]。
不同光照条件对胚胎造成影响的机制不同，组织吸收光子后自身进入激发态，通常以下面几种途径进行光子能量传递[23]：(1)化学反应：组织吸收光子后发生氧化还原反应导致自身裂解，将能量传递给细胞内的氧分子生成ROS；(2)热能：激发态分子将能量传递给周围无辐射能力的物质，能量被吸收导致局部温度升高，引发热损伤；(3)离子辐射效应：光子被组织吸收后释放出自由电子，自由电子在与其他分子碰撞过程中再次吸收光子自身能量增加。自由电子能量积累至一定程度后，可引发更多额外的自由电子产生，从而导致辐射效应。此时，生物分子电离生成大量低密度等离子体造成组织光化学损伤；(4)击穿作用：当组织接收的光照能量大于或等于细胞的光学击穿阈值时，等离子体可产生超音速冲激波直接击穿细胞，引起细胞损伤或凋亡。高量级光照密度的强烈发光带宽，会造成组织的瞬间击穿作用。
在大多数ART实验室IVF常规操作中普遍采取暗中操作，但显微镜的光源是该过程无法避免的且胚胎接触的光照95%来自于显微镜，受显微镜型号、光照波长、剂量、显相率等因素影响[3]。
根据显微成像的衍射理论，早期胚胎体外发育常用显微镜可分为以下几类：普通光学显微镜、荧光显微镜、非线性光学显微镜及一些新的如多光子显微镜、正电子发射断层成像等综合型显微镜[24,25]。普通光学显微镜分辨率低，层析成像能力不足，以人眼直接观察，不能充分满足科学发展的需要。荧光显微镜是荧光与光学显微技术相结合的产物，依赖于荧光色素染色或者使用免疫荧光抗体。非线性光学显微镜也是胚胎观察常用显微镜之一，主要为谐波振荡显微镜(HGM)，包括二阶谐波和三阶谐波显微镜。HGM通过利用组织内有机物的非线性光学现象，无需染色，需高光强度(上百GW/cm2)的激光激发，但高光强度照射易导致组织解离。该类显微镜通过增加激光脉冲重复频率来加强谐波强度，需保证每一脉冲能量低于多光子破坏效应临界值。已有研究表明非线性光学显微镜照明体系的非线性光波与胚胎组织的交叉反应会引起胚胎组织局部损伤[26]。Watanabe等[27]用低光照剂量的HGM照射小鼠桑葚胚24 h，发现在0.9～4 J低照射能量即可造成囊胚着床率严重降低。近年来Time－lapse系统的出现使人们实现了在不脱离胚胎培养设备的最佳培养条件下对胚胎体外发育进行全程监控。通过设定5～20 min间隔性的自定义图像采集发送至电脑，监控胚胎发育的动态过程，提供给人们更多早期胚胎卵裂时间节点、卵裂球形态变化等相关信息，一般用于对预移植胚胎进行植入前遗传学筛查(PGS)。Time－lapse系统一般采用低强度LED灯光持续进行拍摄，存在周期性曝光、电磁场效应、机器运转过程的热积累效应、胚胎污染、培养基成分的稳定等风险因素，导致其安全性备受质疑。针对Time－lapse系统低剂量的持续光照是否会对早期胚胎造成损伤人们存在较大争议[28]。Kirkegaard等[29]将来自59个病人的676枚卵子分成两组(Time－lapse监控组和对照组)进行随机实验，评估Time－lapse系统的安全性。结果表明，2个实验组在4－细胞期、7～8细胞期、囊胚期等不同阶段均没有显著性差异，因此他们认为Time－lapse系统培养体系的安全性基本上等同于传统培养体系。Cruz等[30]将来自60对病人的478个胚胎分成Time－lapse系统EmbryoScope监控组和对照组进行观察统计，结果表明两组胚胎在成囊率、胚胎质量、成功妊娠率等方面差异无统计学意义。Taylor等[31]发现长时间的低剂量光照比短暂的高剂量光照所造成的热效应更大，并在培养基及胚胎中造成的热量传播更加广泛，对胚胎发育影响更为严重，但目前造成该现象的机制不明。为了避免Time－lapse的胚胎光毒性作用，Primo Vision系统采用了比EmbryoScope系统更低的光照剂量，同时其所有曝光系统均减少了对胚胎起关键伤害作用的短波光，其整体拍摄光照剂量甚至低于常规ART操作中胚胎所接触的光剂量水平[32]。然而鉴于ART的重要性，Time－lapse系统在常规临床中的推广还需更全面更谨慎的实验验证及数据支持。理论上，任何类型的显微镜光照系统在临床ART上的使用均应慎重对待。
实验室常用显微镜光源按照其型号、激发光波长、脉冲宽度、光照能量大致分为以下几类[23]：(1)弱聚焦持续光照(<100 mW/cm2)，一般用于促进胚胎细胞增殖或利用光敏剂进行光动力学治疗，以及明视野相差荧光成像等。(2)高功率(50～200 mW/cm2)及高聚焦特性光束(NA值约1.0～1.4)，一般聚焦于细胞一个或几个点上，光束持续照射捕获细胞、细胞器及细胞外部颗粒进行显微成像，也可用于细胞、亚细胞结构的光裂解。(3)高能量(1～1 000 GW/cm2)、高频率(80～120 MHz)、短时间(50～5 000 fs)、近红外(700～1 300 nm)脉冲的照射光，一般用于高功率多光子显微镜，可进行胚胎和细胞样品二维或三维空间扫描成像。在ART实际操作过程中，来自于显微镜的光照强度一般在2 500～5 000 lux(约20～30 W/m2，150 lux≈1 W/m2，W＝J/s)，环境光仅为200～400 lux(0.1～0.5 W/m2)。常规IVF、ICSI、PGD操作中胚胎所获得的光照能量约为3.2～17.4 KJ/m2。
光照对胚胎所造成的影响具有时间依赖性，照明时间所占拍摄间隔周期的比例(显相率)影响也较大。显相率低于20%时，果蝇胚胎可完整发育至幼虫期；高于20%时，果蝇胚胎存活率开始降低，与照明时间呈反比。恒定参数下，250 fs比100 fs激发光脉冲对胚胎的伤害作用大，可造成细胞膜在细胞分裂过程中内陷速率增大[23]。Zhang等[33]发现胚胎体外培养过程中利用显微镜每天观察一次的频率也会造成胚胎发育率及质量的下降，减少观察频率可相应提高胚胎成囊率。
通常情况下，ART中显微镜光谱的波长范围在近紫外(UV，300 nm)～近红外(NIR，1 300 nm)之间，而DNA的光吸收峰为260 nm，因此任何紫外光谱范围内(10～380 nm)的光线均有可能造成胚胎细胞遗传性损伤或细胞毒性。Takenaka等[5]利用太阳光、冷白色和暖白色荧光灯3种光源分别照射小鼠受精卵15 min后，挑选形态发育正常的胚胎进行移植，发现太阳光组和冷白色荧光灯组胎儿存活率均显著下降。其中含有紫外成分的太阳光对小鼠受精卵的伤害最为严重，胚胎存活率仅为25%；其次是含有较高蓝光等短波光成分的冷白色荧光，胚胎存活率为44%；较高长波光成分的暖白色荧光灯对胚胎存活率的影响则不显著，接近于对照组的73%。可见光中蓝光成分(400～500 nm)由于其自身的高能量及较强的组织穿透力，可造成细胞的胞内损伤，比长波长的光线对胚胎造成的伤害作用强，其危害剂量约为1～10 KJ/m2。其次是红外线(700～4 000 nm)可通过热能及氧化压力造成人配子及胚胎的死亡。
尽管人们已经证实光照对胚胎发育具有一定的伤害作用，但目前国内外均没有对辅助生殖领域ART过程常规光照使用条件作出明确规定。美国食品和药物监督管理局(FDA)对激光在生殖领域的应用作了限定，只允许3种激光(SALS、OLSS、HTZILOS)应用于早期胚胎透明带微孔切割以辅助卵子受精及胚胎的孵出和着床，但常规IVF中所使用的光照光谱范围、时间、强度等均未做出限定。因此，我们建议胚胎操作、培养中显微镜照射条件可采取以下具体措施进行改善：(1)在显微镜上加滤波片(绿光通透性滤波片、蓝光过滤性滤波片等)避免紫外及蓝光伤害，可有效减少光损伤。人眼对绿光最为敏感，采用绿光透过性滤波片无需增强光照强度即可准确监控胚胎，有效减少了光线对胚胎造成的压力。(2)选择长波长光源显微镜。虽然高量级光照密度下多光子显微镜有可能会造成胚胎组织击穿，但多光子显微镜的激发波长为700～1 300 nm的近红外光。若将光照剂量控制在适当范围内，该波长光照可为胚胎操作提供非常合适的穿透深度，有效减少胚胎细胞的单光子吸收并减轻光照对胚胎发育的不利影响。(3)由于光线对胚胎的干扰具有剂量累积效应，因此通过提高扫描速度、增加同位点扫描延迟、采用随机扫描方式、减少激发位点的重复扫描率等方式也可有效减少光损伤。此外，采取暗中操作、尽可能降低显微镜光照强度、缩短胚胎体外操作时间、选择低氧培养环境、添加抗氧化剂以及建立胚胎与其他细胞体外共培养体系等方法也能有效减少光照对胚胎造成的伤害作用[12]。
目前不同研究所采用脉冲、稳定或扫描光束、聚焦特性、成像时间等光照条件各不相同。同时对胚胎发育阶段划分、形态描述、细胞功能及活力评定等也不一致，导致光毒性评估标准混乱。加上一些数据不完整，且参数缺乏统一性，导致分析光照对胚胎影响的机制非常困难。在利用光照处理胚胎后，大多数研究者采用鉴定细胞活力、统计受精率、成囊率等手段评估光照对胚胎的影响。该评估标准过于简单，主观判断性强，无法深入揭示光照对胚胎影响的作用机制。
近年来单细胞测序技术飞速发展。研究表明，对小鼠骨髓干细胞来源的树突细胞转录组进行单细胞测序，发现不同外界条件刺激下其干扰素旁分泌信号所调节的反应会发生相应的变化[34]。单细胞外显子组测序显示肿瘤中一些点突变随时间逐渐产生大量的克隆多样性及许多罕见的突变。单细胞测序技术或为研究光照对早期胚胎的影响提供了一个崭新的偏差性小的方法，可以更精确地研究胚胎发育过程。目前人们已经可以检测单个胚胎细胞内发生的多种基因突变、全基因组转录组变化及甲基化状态等，还可对预移植胚胎进行基于单细胞测序的产前基因诊断(PGD)探究突变致病基因的遗传特点。胚胎经光照后，通过检测自然受精胚胎与光照后的胚胎之间转录组或表观遗传学表现，可发现受光照胚胎细胞与未接触光照胚胎细胞之间的异质性、信号传递与联系机制等的变化。单细胞测序可以避免胚胎异质性的中和及细胞信息被屏蔽，为客观评估光照对胚胎细胞的影响提供可能。早期胚胎发育过程中会发生大量的转录组调控和表观遗传学重编程，这些均可作为研究光照对胚胎影响的关键参考因素。本课题组正是通过对人类及小鼠的早期胚胎单细胞转录组进行研究，发现转录组可动态并精准地反映胚胎从合子期至囊胚期细胞周期、基因调控等的顺序性变化[35]。从技术层面来说，转录组及DNA甲基化分析有助于揭示光照刺激下胚胎各细胞表观遗传学远端控制元件与主要的基因表达之间的动态联系，直接反映胚胎质量，深入、客观地评估光照对早期胚胎的影响。因此，我们认为单细胞测序可为评估光照对胚胎的影响提供更全面精确的基因组学信息。当然单细胞测序目前还存在一些技术限制如噪音缺陷性、覆盖不均匀、稀疏数据的出现、扩增偏差、等位基因遗漏等，但随着生物信息技术的发展我们有理由相信通过单细胞测序，人们可以更多更准确地研究光照等外界环境因素对早期胚胎造成的影响。
光照对胚胎的损伤是人类IVF探索中绝无参照标准的关键因素，无法通过无限接近人体环境(完全无光照)来降低影响，目前仍无统一且准确的早期胚胎光毒性损伤评估标准。因此，大量的基础研究显得尤为重要，需要进一步探索和完善。我们相信，光照评估标准的建立将对规范临床照明条件和提高ART安全性产生深远的影响。
