探讨脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对再生障碍性贫血(AA)患者调节性T细胞(Treg细胞)数目、功能及其上淋巴细胞功能相关分子-1(LFA-1)表达的影响。
分离2015年5月至2016年7月济南军区总医院血液科收治的20例初治的非重型再生障碍性贫血(NSAA)患者及同期门诊体检的10名健康对照者外周血单个核细胞(PBMCs)，流式细胞术分别检测PBMCs单独培养、PBMCs ＋UC-MSCs共培养条件下Treg细胞比例及其细胞上LFA-1的表达变化；磁珠分选AA患者Treg细胞及CD4＋CD25－T细胞，CFSE标记CD4＋CD25－T细胞，分别检测Treg细胞、Treg细胞与UC-MSCs共培养后对CD4＋CD25－T细胞分裂能力的影响。
AA组淋巴细胞上LFA-1平均免疫荧光强度明显高于健康对照组[(71.4±10.1)比(52.5±8.7)，P＝0.002]，但Treg细胞上的LFA-1表达与健康对照组差异无统计学意义(P＝0.199)。与AA患者PBMCs单独培养相比，UC-MSCs可明显降低AA患者Treg细胞上LFA-1的比例[(20.96±1.76)%比(44.26±1.19)%，P＝0.012]，升高AA患者Treg细胞的比例[(5.33±1.14)%比(1.94±0.65)%，P＝0.003]。AA患者Treg细胞、Treg细胞与UC-MSCs共培养后对CD4＋CD25－T细胞分裂能力的影响，差异无统计学意义(P＝0.290)。
AA患者淋巴细胞上LFA-1平均免疫荧光强度明显增高，可能是参与AA发生的一个重要机制。UC-MSCs可明显降低AA患者Treg细胞上LFA-1的表达比例，提高Treg细胞比例，但对单个Treg细胞的功能可能无明显改善。
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再生障碍性贫血(AA)是一组免疫相关性疾病，患者体内异常活化的免疫系统导致造血衰竭是AA发生的重要机制[1]，而Treg细胞数目及功能缺陷，可能是造成免疫活化的重要原因[2]。脐带血间充质干细胞(UC-MSCs )具有较强的免疫调节作用[3]，对AA有一定的疗效，但其作用机制并不完全明确。本实验拟通过研究UC-MSCs对AA患者Treg细胞数目、功能及其细胞上淋巴细胞功能相关分子-1(LFA-1)表达的影响，分析LFA-1在调节Treg生成及功能发挥过程中可能存在的作用，进一步阐述UC-MSCs对AA治疗的影响。
选择2015年5月至2016年7月济南军区总医院收治的20例初治的非重型再生障碍性贫血(NSAA)患者，其中男6例，女14例，中位年龄29(7～66)岁，入组AA患者诊断均参照AA的诊断及治疗指南[4,5]。对照组为同期门诊体检的10名健康人，其中男4名，女6名，中位年龄25(12～54)岁。两组间性别、年龄差异无统计学意义(均P>0.05)。所有患者均签署知情同意书，并获得我院伦理委员会批准。
RPMI改良完全培养液(HyClone公司)；流式细胞抗体CD4-FITC、CD25－PerCP-cy5.5、Foxp3-PE、CD11a-PE-cy7、IgG1、κ-PE、CD4-APC、CD127-FITC、CFSE，CD4＋T淋巴细胞、CD25＋T淋巴细胞、CD127＋T淋巴细胞分选试剂，链霉亲和素磁珠微粒，Falcon™，IMagnet™(均购自美国BD公司)；CD3、CD28及CD11a单克隆抗体(Abcam公司)；A00-1-1102流式细胞仪、FC500流式细胞仪(Beckman Coulter公司)。
无菌条件下，UC-MSCs分离、传代培养至第3代，流式检测表面标志[6]。采取AA患者外周血30 ml，EDTA-K2抗凝，应用细胞密度梯度离心法分离PBMCs。
PBMCs单独培养组：PBMCs 1×106个细胞/孔；PBMCs＋UC-MSCs共培养组：加入新鲜分离的UC-MSCs 1×105个细胞/孔，24 h贴壁后去上清，加入PBMCs 1×106个细胞/孔。两组均接种于12孔培养板内，置于1 ml RPMI改良完全培养液中，添加10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/ml青霉素链霉素双抗，置于37 ℃，5%CO2及饱和湿度培养箱内培养3 d。用倒置显微镜观察细胞生长情况，用锥虫蓝检测其细胞活性(>90%)，收集培养后细胞混悬液，行流式细胞学检查。
收集培养后细胞悬液，离心重悬细胞至终体积100 μl，分别加入CD4-FITC 20 μl，CD25－PerCP-cy5.5 5 μl, CD11a-PE-cy7 5 μl，混匀后4 ℃避光孵育30 min，加入2 ml着色缓冲液，离心去除上清，加入1 ml 1×Fix/Perm缓冲液，混匀后4 ℃避光孵育50 min，加入1 ml 1×Perm/Wash缓冲液，离心后重复洗涤1次，重悬细胞至终体积100 μl，实验组、对照组分别加入Foxp3-PE 5 μl, IgG1，κ-PE 20 μl，混匀后4 ℃避光孵育50 min，重复洗涤2遍，离心后重悬细胞至终体积200 μl，上机检测。
免疫磁珠法分选CD4＋CD25＋CD127-Treg细胞、CD4＋CD25－T细胞，检测细胞活性及纯度。分选后细胞均培养于96孔U形板内，5 μg/ml CD3包板，培养过程中每孔加入CD28抗体(2 μg/ml)。培养共分3组：(1)CD4＋CD25－T细胞单独培养组：CD4＋CD25－T细胞1×105个/孔；(2)CD4＋CD25－T细胞＋Treg细胞共培养组：CD4＋CD25－T细胞1×105个/孔，Treg细胞1×104个/孔；(3)Treg＋UC-MSCs处理后与CD4＋CD25－T细胞共培养组：Treg细胞与UC-MSCs以10∶1的比例共培养3 d后(培养体系同步骤4)，收集Treg细胞1×104个/孔移入96孔U形板内与CD4＋CD25－T细胞1×105个/孔共培养；各组培养体系均为200 μl RPMI改良完全培养液，添加10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/ml青霉素链霉素双抗，共培养7 d，每组设置3个复孔，结果取平均值。
细胞培养前，用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)提前标记免疫磁珠分选的CD4＋CD25－T细胞，CFSE终浓度5 μmol/L，37 ℃水浴15 min后，等体积小牛血清终止10 min，9倍体积的磷酸盐缓冲液(PBS)液清洗2次后，培养基液重复清洗1次，收集细胞行细胞培养。培养后收集细胞混悬液，离心重悬至200 μl PBS中，上机检测CD4＋CD25－ T细胞CFSE平均荧光强度变化，分析其细胞分裂能力变化。CD4＋CD25－ T细胞的分裂细胞比例＝分裂的细胞数/细胞总数。
SPSS 19.0统计软件分析。构成比之间比较(如性别)采用χ2检验。AA组与健康对照组之间采用两独立样本t检验，同一样本不同培养条件下行配对样本t检验，数值用
±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。
LFA-1广泛分布于淋巴细胞表面，AA组表达比例与健康对照组差异无统计学意义，但AA组淋巴细胞上LFA-1平均免疫荧光强度明显高于健康对照组[(71.4±10.1)比(52.5±8.7)，P＝0.002]；与UC-MSCs共培养后，AA组T淋巴细胞上LFA-1表达比例明显降低至(85.7±2.9)%，平均免疫荧光强度显著降低至(12.9±1.55)(P<0.000 1)。AA组Treg细胞上的LFA-1表达比例与健康对照组差异无统计学意义(P＝0.199)；与AA患者PBMCs单独培养相比，UC-MSCs可显著抑制AA患者Treg细胞上LFA-1的表达比例[(20.96±1.76)%比(44.26±1.19)%，P＝0.012]。
与健康对照组相比，AA患者Treg细胞比例明显降低(P＝0.007)；与AA组PBMCs单独培养相比，UC-MSCs可显著增加AA组Treg细胞比例[(5.33±1.14)%比(1.94±0.65)%，P＝0.003]。
免疫磁珠法分离，AA患者CD4＋ CD25－T淋巴细胞的得率为(4.32±0.38)×106个，细胞分选纯度为(93.9±0.7)%；Treg细胞的得率为(2.25±0.19)×105个，纯度为(88.9±0.9)%，培养前、后均保持了良好的活性，差异无统计学意义(P＝0.351)。
CD4＋CD25－T淋巴细胞单独培养条件下，AA组与健康对照组CD4＋CD25－T淋巴细胞中分裂细胞比例差异无统计学意义[(88.71±1.47)%比(89.39±0.92)%，P＝0.147]；CD4＋CD25－T淋巴细胞与Treg细胞共培养条件下，AA组CD4＋ CD25－T淋巴细胞中分裂细胞比例较健康对照组明显增加[(81.95±1.07)%比(39.83±1.02)%, P<0.000 1]。AA组Treg细胞、Treg细胞＋UC-MSCs共培养后，Treg细胞对CD4＋ CD25－T淋巴细胞分裂能力的影响，差异无统计学意义(P＝0.290)。
AA患者体内免疫系统的异常活化，对骨髓造血细胞的直接或间接损伤是导致AA发生的重要机制，而Treg细胞的数目及功能缺陷在其中起到关键作用[7]。
近年来的实验表明，LFA-1不仅可参与多种免疫反应过程，介导免疫突触的形成，促进效应细胞的迁移及对靶细胞的杀伤作用[8], 而且可介导Treg细胞生成及功能发挥[9]，在AA的发病机制中可能存在重要影响。我们实验发现，与健康对照组相比，AA组淋巴细胞上的LFA-1平均免疫荧光强度明显增高。近年来研究表明部分T细胞上过度活化或过度表达的LFA-1，可导致白细胞过度聚集在相关组织，最终导致免疫失调或自身免疫性疾病[10]。因此，淋巴细胞上LFA-1的过度表达可能是AA发生的一个重要机制。但AA患者Treg细胞上LFA-1表达与健康对照组无明显差异，这提示AA中Treg细胞的数目及功能缺陷并不是由于LFA-1的表达异常，可能存在其他的损伤机制，如Treg细胞上细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)表达降低，穿孔蛋白表达明显增加等[2]，具体的损伤机制仍有待进一步研究。
多项实验证明UC-MSCs可抑制多种免疫反应，调节不同类型的免疫细胞，释放可溶性免疫抑制分子，从而发挥免疫抑制作用[11]，对AA的治疗起到一定的作用。我们实验发现，与AA组PBMCs单独培养相比，UC-MSCs可显著降低AA组淋巴细胞上LFA-1的表达，这可能是UC-MSCs发挥免疫抑制作用的一个重要方面。此外，UC-MSCs可抑制AA组Treg细胞上LFA-1的表达，同时增加AA患者Treg细胞比例。近年的研究发现，LFA-1可介导Treg细胞的调节，对Treg细胞的生成起到一定的抑制作用。Verma等[12]研究发现LFA-1与其配体细胞间黏附分子-1(ICAM-1)结合，可诱导T细胞对转化生长因子-β(TGF-β)耐受，减少Treg细胞的分化。Josefowicz等[13]在小鼠体内应用LFA-1单克隆抗体后，小鼠外周血及淋巴结内的Treg细胞均明显升高。Verhagen等[14]研究发现，体外封锁LFA-1可诱导叉状头转录因子P3(Foxp3)生成，显著增加抗原诱导的Treg细胞生成。因此，UC-MSCs可能通过抑制AA患者Treg细胞上LFA-1的表达，从而诱导Treg细胞生成，对AA起到一定的调节作用。
此外，我们对于Treg细胞功能的进一步研究发现，与健康对照组相比，AA患者Treg细胞抑制功能缺陷，进一步验证之前的观点，AA患者体内存在明显的Treg质量及功能异常[7]。我们发现经UC-MSCs处理后的AA患者Treg细胞与未经处理的同等数目的Treg细胞相比，其对CD4＋ CD25－T淋巴细胞的分裂能力的影响无统计学差异，提示UC-MSCs可能并不直接改善单个Treg细胞的抑制功能。Selleri等[15]研究认为，UC-MSCs发挥免疫抑制作用可能并不是通过诱导Foxp3＋Treg细胞生成，而是通过诱导辅助性T细胞1(Th1)大量释放白细胞介素-10产生。Verhagen等[14]研究也进一步证明，体外封锁LFA-1虽可诱导Foxp3生成，但由于Foxp3的不稳定性，Treg细胞的抑制功能并无显著提升。
综上所述，AA患者淋巴细胞上LFA-1平均免疫荧光强度明显增高可能是参与AA发生的一个重要机制。UC-MSCs一方面可通过抑制淋巴细胞上LFA-1的表达，减少细胞间的黏附作用；另一方面UC-MSCs可能通过抑制AA患者Treg细胞上LFA-1的表达，升高Treg细胞的比例，但对于单个Treg细胞的功能可能无明显改善。但总体来说，UC-MSCs虽未增强同等数目下Treg细胞对CD4＋CD25－T淋巴细胞的抑制功能，但显著提高了Treg细胞数目，因此其总的效应仍是增强了AA患者体内Treg细胞的免疫负调控作用，减弱异常活化的免疫反应。
