周伟燕; 汪静; 禹松林; 王冬环; 曾洁; 张天娇; 闫颖; 张江涛; 陈文祥; 张传宝

doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.42.014

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• 新技术新方法 •

胆固醇水溶液国家一级标准物质的定值与不确定度评定

中华医学杂志, 2017,97(42) : 3338-3342. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.42.014

摘要

目的

对胆固醇水溶液标准物质进行定值和不确定度评定。

方法

以胆固醇标准物质GBW09203b为原料，称量配制6个浓度水平的环糊精水溶液标准物质。用常规方法进行均匀性和同步稳定性研究，评价不均匀性、不稳定性引入的不确定度。定值过程的不确定度主要来源于样本原料、称量和密度测定。将不均匀性、不稳定性和定值产生的不确定度合成计算总不确定度。

结果

6个浓度水平胆固醇标准物质由不均匀性引入的相对不确定度分别为0.14%、0.11%、0.13%、0.47%、0.39%和0.11%；－70 ℃下由不稳定性产生的相对不确定度均为0.25%；定值产生的相对不确定度分别为0.06%、0.05%、0.05%、0.05%、0.05%和0.05%。6个浓度水平胆固醇标准物质的认定值(标准值±扩展不确定度)分别为(0.651±0.004)、(1.310 ±0.007)、(2.574±0.015)、(5.210±0.055)、(7.710±0.072)、(10.242±0.056)mmol/L。

结论

研制的6个浓度水平胆固醇水溶液一级标准物质均匀、稳定，定值可靠。与不均匀性和不稳定性产生的不确定度相比，定值测量产生的不确定度比较小。

引用本文: 周伟燕, 汪静, 禹松林, 等. 胆固醇水溶液国家一级标准物质的定值与不确定度评定 [J] . 中华医学杂志, 2017, 97(42) : 3338-3342. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.42.014.

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胆固醇是临床实验室常规检验项目，临床上以其水平的高低作为动脉粥样硬化性心血管病的重要危险因素。不同实验室间胆固醇检测结果的标准化需要单个实验室测定结果准确可靠及不同实验室间结果准确可比。建立参考(标准)系统(包括参考测量程序和标准物质)是实现实验室间检验结果标准化的基础。制备不同级别的标准物质，尤其是纯度标准物质，在量值溯源、检验结果标准化的过程中发挥着非常重要的作用。

胆固醇不溶于水，在参考方法或常规测定中，通常将胆固醇溶于甲醇或乙醇中，以用作校准物或质控物，由于甲醇或乙醇挥发性较大，体积随温度变化较大，且基质同实际临床样本差距较大，容易引起测定结果的偏差。因此目前国际上尚没有水溶液基质的胆固醇标准物质。本研究按照ISO Guide 35^[1]和国家一级标准物质技术规范(JJG 1006-1994)^[2]的要求，以水溶液作为基质，配制了6个浓度水平的胆固醇标准溶液，被批准为GBW09823、GBW09824、GBW09825、GBW09826、GBW09827和GBW09828。标准物质采用称量配制定值，不确定度参照《测量不确定度评定与表示》(JJF1059.1-2012)^[3]、《化学分析测量不确定度评定》(JJF1135-2005)^[4]和《化学分析中不确定度的评估指南》(CNAS-GL06-2006)^[5]进行评定。将不均匀性和不稳定性引入的不确定度同测量不确定度合成，计算标准不确定度和扩展不确定度。本文对胆固醇标准物质不确定度的来源和各项不确定度的计算进行了详细的描述。

材料与方法

一、材料

1．试剂材料：

胆固醇纯度标准物质GBW09203b(白色粉末，卫生部北京老年医学研究所和国家标准物质研究中心，纯度99.7%，不确定度0.1%)。叠氮钠为白色粉末，纯度≥99.5%，美国Sigma公司产品。甲基-β-环糊精(MBCD)购自淄博千汇生物科技有限公司，纯度≥98%。

2．仪器与设备：

Cubis^®MSA125P-100-DI十万分之一天平和Sartorius BSA 623S-CW千分之一天平。天平使用前用标准砝码验证，核查其准确性，并进行天平自校准。控制实验室温度为(25±2)℃，湿度30%～70%。Anton Paar数字式密度计DMA4500M(奥地利安东帕公司)。

二、称量定值

1．胆固醇MBCD水溶液的配制：

将胆固醇标准物质GBW09203b放入真空干燥箱中50 ℃减压干燥10 h。称取约300 g MBCD加入到含有0.1%叠氮钠的水中，加水至溶液重量为1 500 g，终浓度为20%，混匀后微孔滤膜过滤，收取滤液。称取60.6、123、235、475、720和950 mg的GBW09203b分别置于可密封的250 ml具盖容器中，向各容器中加入20%的MBCD滤液250 g。封口涡旋混合24 h，将混合后的各溶液按每支1 ml分装至2 ml玻璃安瓿，－70 ℃保存。

2．称量定值：

以上溶液配制中标准物质用十万分之一天平称量，MBCD溶液用千分之一天平称量。记录加入的GBW09203b和MBCD溶液的准确质量。配制6个浓度水平的胆固醇标准溶液，相应的胆固醇浓度分别为25、50、100、200、300、400 mg/dl(相当于0.647、1.293、2.586、5.172、7.758和10.344 mmol/L)，分别为GBW09823、GBW09824、GBW09825、GBW09826、GBW09827和GBW09828。各溶液配制的详细数据见表1。

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表1

胆固醇标准物质的浓度计算数据

表1

胆固醇标准物质的浓度计算数据

样本	GBW09203b(g)	MBCD(g)	密度(mg/ml)	胆固醇(g)	溶液(g)	质量浓度(mg/g)	体积浓度(mg/dl)	物质的量浓度(mmol/L)
GBW09823	0.060 73	255.470	1.062 68	0.060 55	255.53	0.236 95	25.18	0.651
GBW09824	0.120 61	251.927	1.061 72	0.120 25	252.05	0.477 09	50.65	1.310
GBW09825	0.235 35	250.263	1.062 68	0.234 64	250.50	0.936 71	99.54	2.574
GBW09826	0.477 22	250.482	1.062 54	0.475 79	250.96	1.895 88	201.44	5.210
GBW09827	0.709 90	251.035	1.060 33	0.707 77	251.74	2.811 46	298.11	7.710
GBW09828	0.941 76	250.970	1.062 49	0.938 93	251.91	3.727 23	396.01	10.242

注：GBW09203b：胆固醇纯度标准物质；MBCD：甲基-β-环糊精

3．密度测量：

使用密度计对各溶液的密度进行测定，环境温度20 ℃。将GBW09823～ GBW09828置室温下(环境温度20 ℃)平衡1 h，缓缓摇匀，然后开封进行测定。每个样本测定3次，取平均值为该溶液的密度测定结果。详细数据见表1。

三、不确定度分析

1．不确定度来源：

包括不均匀性对不确定度的贡献、不稳定性对不确定度的贡献和定值测量不确定度。

2．不均匀性不确定度：

不均匀性的不确定度(u_bb)等于瓶间均匀性的方差(s_bb)，由ISO Guide35^[1]的公式：当MS_among<MS_within时，使用以下公式：u_bb＝s_bb＝。公式中MS_among、MS_within、νMS_within和n分别代表均匀性方差分析中组间均方、组内均方、组内自由度和每瓶样品的测定次数。

3．不稳定性不确定度：

根据ISO Guide35指南，稳定性对不确定度的贡献主要包括长期不稳定性的不确定度(u_lts)和短期不稳定性的不确定度(u_sts)。短期不稳定性主要考虑样本通过运输到达使用者的时间内带来的不稳定性，由于我们选定的运输条件为干冰运输，一般2 d左右即可到达，因此运输(短期)不稳定性造成的不确定度可以忽略。当不存在显著性降解时，在给定的有效期内，u_lts可用下式估计：u_lts＝s_b·t 。s_b和t分别代表稳定性趋势分析(回归分析)中斜率的标准偏差和储存时间。由公式计算得到标准物质中胆固醇的u_lts。

4．定值测量不确定度：

此标准物质采用称量配制，样本的测量不确定度(u_char)来源主要包括样本原料的不确定度、称量产生的不确定度和密度测定产生的不确定度。不确定度的合成根据CNAS-GL06：2006^[5]，数值y的合成标准不确定度[u_c(y)]和其所依赖的独立参数x₁，x₂…x_n的不确定度之间的总关系式如下：

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5．总不确定度：

根据ISO Guide35指南，标准物质的总不确定度(u_CRM)是通过合成定值测量、均匀性和稳定性对特征值总不确定度的贡献来评估的。

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四、统计学分析

数据通过EXCEL 2007和SPSS 17.0软件分析。认定值的表达方式为：标准值(mmol/L)±扩展不确定度(mmol/L，U)，扩展因子(k)＝2。P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、定值数据处理

使用的胆固醇原料为纯品粉末(纯度99.7%，不确定度0.1%)，因此加到溶液中的胆固醇的重量m₀就等于GBW09203b的重量(m₁)×纯度(P)。溶液的重量(m)等于GBW09203b的重量(m₁)和MBCD的重量(m₂)之和。胆固醇的质量浓度C₁为胆固醇的重量m₀除以溶液重量m。将胆固醇质量浓度C₁(mg/g)除以密度ρ(mg/ml)计算得到胆固醇体积浓度C₂(mg/dl)：C₂＝C₁/ρ×100，并根据胆固醇分子量计算物质的量浓度C₃(mmol/L)。计算数据见表1。

二、不均匀性的不确定度

不均匀性的不确定度(u_bb)等于瓶间均匀性的方差(s_bb)，根据ISO Guide35的公式计算得到各标准物质中的u_bb。GBW09823～GBW09828不均匀性引入的相对不确定度分别为0.14%、0.11%、0.13%、0.47%、0.39%和0.11%；标准不确定度分别为0.000 9、0.001 4、0.003 5、0.024 2、0.030 2和0.011 3 mmol/L。

三、不稳定性不确定度

不存在显著性降解时，在给定的有效期内，长期稳定性的不确定度(u_lts)可用下式估计：u_lts＝s_b·t。s_b和t分别代表稳定性趋势分析中斜率的标准偏差和储存时间。由公式计算得到标准物质的u_lts。－70 ℃、－20 ℃、4 ℃和25 ℃下由不稳定性产生的相对不确定度分别为0.25%、0.19%、0.29%、0.34%，标准不确定度分别为0.019、0.015、0.022和0.026 mmol/L。

四、定值测量不确定度

定值测量不确定度来源主要包括样本原料的不确定度、称量产生的不确定度和密度测定产生的不确定度。

1．原料引入的不确定度[u_c(P)]：

配制原料胆固醇为我国有证标准物质GBW09203b，同时也是JCTLM推荐的国际公认的参考物质。此物质为粉末状的纯度标准物质，认定纯度P为99.7%，不确定度0.1%，k＝2，相对标准不确定度为0.05%。

2．称量产生的不确定度[u_c(m)]：

以GBW09823为例(表2)。称量产生的不确定度主要包括：称量溶质GBW09203b使用0.000 01 g分度的分析天平，天平波动范围为0.01 mg，称样量为0.060 73 g；天平校正产生的不确定度，证书给出的不确定度为U＝0.01 mg，k＝2，换算成标准不确定度为0.005 mg，此两项合成得到胆固醇质量m₁的相对不确定度为0.018%。

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表2

各标准物质中称量带来的不确定度

表2

各标准物质中称量带来的不确定度

样本	称量值(g)	相对不确定度(%)
GBW09823	0.060 73	0.031 9
GBW09824	0.120 61	0.016 1
GBW09825	0.235 35	0.010 3
GBW09826	0.477 22	0.005 5
GBW09827	0.709 90	0.004 0
GBW09828	0.941 76	0.003 3

称量溶剂20%环糊精水溶液所用0.001 g分度的分析天平，天平波动范围为0.001 g，称样量为255.470 g；天平校正产生的不确定度，证书未给出超出25 g的不确定度，按25 g的相对不确定度(0.004%)计算得250 g时U＝0.01 g，k＝2，换算成标准不确定度为0.005 g，此两项合成得到溶剂质量m₂的相对不确定度为0.002%。

因为胆固醇的质量浓度计算公式为：C₁＝，因此，此浓度水平溶液中胆固醇的u_c(m)＝。

3．密度测定产生的不确定度[u_c(ρ)]：

采用密度计进行密度测定，该密度计内置温度调节原件，测量的温度条件为(20±0.5)℃，在测定未知样本之前先测定水的密度，结果无误后再开始测量未知样本。各标准溶液的u_c(ρ)见表3。

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表3

各标准物质中密度测定带来的不确定度

表3

各标准物质中密度测定带来的不确定度

样本	密度均值(g/ml)	扩展不确定度(g/ml)	扩展因子(k)	标准不确定度(g/ml)	相对不确定度(%)
GBW09823	1.062 68	5.00×10^－5	2	2.50×10^－5	0.002 4
GBW09824	1.061 72	5.00×10^－5	2	2.50×10^－5	0.002 4
GBW09825	1.062 68	5.00×10^－5	2	2.50×10^－5	0.002 4
GBW09826	1.062 54	5.00×10^－5	2	2.50×10^－5	0.002 4
GBW09827	1.060 33	5.00×10^－5	2	2.50×10^－5	0.002 4
GBW09828	1.062 49	5.00×10^－5	2	2.50×10^－5	0.002 4

4．定值测量不确定度(u_char)：

各标准物质中胆固醇定值测量不确定度评估方式相似，即将原料引入u_c(P)、称量引入u_c(m)和密度引入u_c(ρ)的3种相对不确定度进行合成得到定值测量的相对不确定度(u_char)，各标准物质定值测量不确定度来源分析见表4。

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表4

胆固醇标准物质定值测量不确定度来源分析(%)

表4

胆固醇标准物质定值测量不确定度来源分析(%)

样本	u_c(P)	u_c(m)	u_c(ρ)	u_char
GBW09823	0.050 0	0.031 9	0.002 4	0.059 3
GBW09824	0.050 0	0.016 1	0.002 4	0.052 6
GBW09825	0.050 0	0.010 3	0.002 4	0.051 1
GBW09826	0.050 0	0.005 5	0.002 4	0.050 4
GBW09827	0.050 0	0.004 0	0.002 4	0.050 2
GBW09828	0.050 0	0.003 3	0.002 4	0.050 2

注：u_c(P)：原料引入的不确定度；u_c(m)：称量产生的不确定度；u_c(ρ)：密度测定产生的不确定度；u_char：定值测量的相对不确定度

五、总不确定度

通过合成定值测量、均匀性和稳定性对样本不确定度的贡献来评估样本的标准不确定度(u_CRM)。取扩展因子k＝2，计算扩展不确定度(U)和相对扩展不确定度(U_rel)，评估结果见表5。

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表5

标准物质的认定值

表5

标准物质的认定值

样本	标准值(mmol/L)	相对不确定度分量			总不确定度
样本	标准值(mmol/L)	u_char(%)	u_lts(%)	u_bb(%)	u_CRM(%)	U_rel(%)	U(mmol/L)
GBW09823	0.651	0.059 3	0.246 4	0.140 9	0.29	0.58	0.004
GBW09824	1.310	0.052 6	0.246 4	0.108 5	0.27	0.55	0.007
GBW09825	2.574	0.051 1	0.246 4	0.134 3	0.29	0.57	0.015
GBW09826	5.210	0.050 4	0.246 4	0.465 1	0.53	1.06	0.055
GBW09827	7.710	0.050 2	0.246 4	0.391 2	0.47	0.93	0.072
GBW09828	10.242	0.050 2	0.246 4	0.110 1	0.27	0.55	0.056

注：u_char：定值测量的相对不确定度；u_lts：长期不稳定性的不确定度；u_bb：不均匀性的不确定度；u_CRM：标准物质的总不确定度；U_rel：相对扩展不确定度；U：扩展不确定度

六、结果表达

认定值的表达方式为：标准值±扩展不确定度，扩展因子k取值为2。胆固醇标准物质GBW09823～GBW09828的认定值分别为(0.651±0.004)、(1.310 ±0.007)、(2.574±0.015)、(5.210±0.055)、(7.710±0.072)、(10.242±0.056)mmol/L。

讨论

研制不同级别的标准物质是实现实验室间检测结果标准化和一致化的基础，尤其是作为校准物质使用的纯度标准物质。由于胆固醇几乎不溶于水(常温下水中溶解度为0.002 mg/ml)，临床上将胆固醇溶于有机溶剂(如氯仿、异丙醇、乙醇等)中，目前国际上尚没有胆固醇水溶液标准物质。有机溶剂溶解的胆固醇溶液具有很多缺点，其中最主要的就是有机溶剂易挥发，受温度、季节等外界因素的影响较大^[6]。而且由于有机溶剂与血清基质明显不同，在取样或样本制备中可能会产生基质误差。若能使用水溶液基质的胆固醇校准溶液，将大大方便临床实验室应用。本研究研制了胆固醇环糊精水溶液标准物质，该物质外观澄清透明，经血流变分析仪检测结果显示，此物质同新鲜人血清样本在不同切力下流变相似，黏滞度同新鲜人血清样本相似。本研究以参考方法为对比方法，评价了这6个标准物质在15种胆固醇常规系统上的互通性。结果显示GBW09823～GBW09828在大多数系统上均具有互通性。只有GBW09826～GBW09828在Thermo和德赛系统上表现很小的正基质效应，在迪瑞系统上表现负基质效应，在其他常规系统上均可等值传递，可用于常规系统的校准物或正确性质控物。本研究研制的标准物质包含胆固醇和甘油两个项目，两个项目的样本制备和不确定度评定方法一样，故本文主要描写胆固醇标准物质的制备和不确定度评定。

总不确定度主要包括不均匀性对不确定度的贡献u_bb、不稳定性对不确定度的贡献和定值测量不确定度u_char。不稳定性对不确定度的贡献主要包括长期不稳定性引入的不确定度u_lts和短期不稳定性的不确定度u_sts。短期不稳定性主要考虑样本通过运输到达使用者的时间内带来的不稳定性，由于我们选定的运输条件为干冰运输，运输时间约为2 d，干冰运输的温度一般为－40 ℃左右。由各时间点的变化率计算得到－20 ℃下该物质中甘油和胆固醇每天变化率<0.02%，干冰运输的温度条件下变化率更小，因此运输(短期)不稳定性造成的不确定度可以忽略，不确定度计算时主要考虑长期不稳定性引入的不确定度。

定值测量不确定度是构成物质总不确定度的一部分，总不确定度评定结果显示，与不均匀性和不稳定性产生的不确定度相比，定值测量产生的不确定度比较小。国际上纯度标准物质的不确定度分为两种，一种只标示其定值测量不确定度(不包括不均匀性和不稳定性产生的不确定度)，另一种参照ISO Guide35指南要求需要评定不均匀性、不稳定性和定值测量三者的不确定度，并合成总不确定度。本标准物质的不确定度评定即采用的第二种方法。

本项目研制了6个浓度水平的胆固醇环糊精水溶液国家一级标准物质，此标准物质定值可靠，可溯源至国际单位，均匀性、稳定性良好。

参考文献

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全国法制计量管理计量技术委员会. JJF 1059.1-2012测量不确定度评定与表示[S]. 北京：中国计量出版社，2012.

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中国合格评定国家认可委员会．化学分析中不确定度的评估指南[S]. CNAS-GL06，2006.

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ZhouW, LiH, DongJ, et al. Serum cholesterol measured by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]．Clin Chem Lab Med，2011，49(4):669-676. DOI：10.1515/CCLM.2011.093.

贡献者信息

周伟燕