观察癫痫持续状态细胞模型及动物模型的高迁移率族蛋白1(HMGB1)、N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)受体2B亚单位的表达变化。
(1)孕16～18 d的SD大鼠，取其胎鼠海马神经元培养至第7天，应用无镁细胞外液处理3 h后制备Sombati癫痫细胞模型，将细胞培养皿编号后采用随机数字表法分为Sombati癫痫神经元组、Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养组。采用real－time PCR检测两组胎鼠海马神经元HMGB1、NR2B mRNA。(2)选取体质量相近的SD大鼠，鼠编号后采用随机数字表法分为正常对照组(NS组)和LI－PILO组；LI－PILO组采用LI－PILO腹腔注射诱导大鼠癫痫持续状态模型，采用real－time PCR检测两组SD大鼠海马神经元HMGB1、NR2B mRNA。
Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4、6 h时，HMGB1 mRNA相对表达量分别为0.005 01±0.000 54、0.026 76±0.003 75、0.003 52±0.000 33，与同一时间点Sombati癫痫神经元组HMGB1 mRNA相对表达量相比，均P<0.05；Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4、6 h时，NR2B mRNA相对表达量分别为0.008 84±0.000 69、0.012 23±0.000 90、0.029 11±0.000 71，与同一时间点Sombati癫痫神经元组NR2B mRNA相对表达量相比，均P<0.05。LI－PILO组在造模成功后6、8、10 h HMGB1 mRNA相对表达量分别为0.000 11±0.000 09、0.000 18±0.000 01、0.000 11±0.000 01，与同一时间点NS组HMGB1 mRNA相对表达量相比，均P<0.05；LI－PILD组在造模成功后6、8、10 h NR2B mRNA相对表达量分别为0.196 12±0.009 41、0.232 11±0.006 27、0.272 48±0.005 84，与同一时间点NS组NR2B mRNA相对表达量相比，均P<0.05。
Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4h HMGB1 mRNA相对表达量升高，6 h表达降低；LI－PILO组在造模成功后6、8 h HMGB1 mRNA相对表达量升高，10 h相对表达量降低；Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养组及LI－PILO组NR2B mRNA相对表达量随时间的延长而延长。
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癫痫持续状态(SE)是神经科最为常见的危急重症，其发病机制尚不十分清楚，目前公认的与癫痫持续状态相关的发病机制有缺氧、神经系统炎症反应[1]、脑内的兴奋性及抑制性神经递质失衡等因素有关。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种染色质非组蛋白核蛋白，广泛分布于机体内的真核细胞中，相关实验推测HMGB1作为一种炎症因子，参与癫痫的发病[2]。N－甲基－D－天冬氨酸(NMDA)受体是与Ca2＋通道偶联的离子型兴奋性氨基酸受体，其中NMDA受体2A、2B亚单位在大鼠海马中表达非常丰富[3]，其过度激活可导致兴奋性神经元死亡[4]，有研究报道，癫痫、神经创伤等脑损伤中HMGB1可促使NMDA引起的神经元死亡[5]，但SE后是否与HMGB1促使NMDA变化的报道较少。本研究建立癫痫持续状态细胞模型及动物模型，通过RT－PCR反应对HMGB1、NMDA受体2B亚单位(NR2B)表达变化进行分析。
健康SD大鼠雌性12只、雄性42只，体质量150～200 g，由解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心提供，许可证号：scxk(军)2014－0001。
0.25%胰酶、胎牛血清、DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、B27均购自美国GIBCO公司；多聚赖氨酸、谷氨酰胺购自美国Sigma；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；HMGB1、NMDA引物合成及测序于上海生工生物公司完成；PCR试剂购自北京普凯瑞公司；混合气购自天津泰亚气体公司。
台式高速低温离心机(德国Heraeus公司)，恒温二氧化碳孵化箱，Olympus IX－71荧光倒置显微镜及图像采集系统，美国Bio－Rad荧光定量PCR。
选取E16～18 d的孕鼠，10%水合氯醛2 ml麻醉孕鼠满意后，置于操作台上，酒精消毒孕鼠腹部，剖开腹部取出胎鼠，立即埋于冰内。胎鼠剥除包衣后放入预冷的75%乙醇中1 min，取出放入超净台的解剖液中，在冰面上无菌条件下取出双侧海马组织，置于DMEM/F12培养基中，剪碎海马组织放入50 ml离心管中，加入终浓度为0.125%的胰蛋白酶完全消化后终止消化并吹打，显微镜下细胞计数，调整细胞浓度为1×106/ml，并接种于直径3.5 cm、涂有0.1 mg/ml的多聚赖氨酸的培养皿中，于37 ℃、5%CO2孵育箱饱和湿度培养。细胞孵育6～8 h后更换海马神经元维持培养基，根据细胞生长情况每隔3 d半量换液。体外培养至第7天时，在倒置显微镜工作台上观察细胞形态，生长良好的细胞可作为实验材料。
(1)Sombati癫痫细胞模型制备：依据Sombati等[6]首次应用无镁细胞外液(Mg2＋－free)建立神经元痫样放电模型。将经体外培养7 d的海马神经元置于无镁离子细胞外液中处理3 h制备癫痫神经元模型，再重置于含镁离子正常细胞外液中。(2)癫痫持续状态细胞模型制备：应用Sombati癫痫细胞模型进行间歇低氧处理以制备癫痫持续状态细胞模型。间歇低氧系统采用的是天津医科大学总医院呼吸科呼吸仿真系统1.0 Copyright[7]。暴露的容器为自行设计制作的细胞培养舱。细胞培养舱采用温控器、加热湿化器和微孔滤膜来保证培养舱中的温度为37 ℃，湿度在45%～70%以及培养舱中的无菌环境。预置低氧/再氧合的循环暴露模式，低氧混合气成分含1.5%O2，5%CO2，93.5%N2；正常氧混合气为21%O2，5%CO2，74%N2补充。设置低氧：再氧合的时间为300 s：300 s，循环时间为4 h。结束后把细胞培养舱中细胞培养皿放回37 ℃ 5%CO2孵育箱中培养，根据培养皿编号按照随机数字表法留取复氧后2、4、6 h的细胞标本进行实时荧光定量PCR分析。(3)癫痫持续状态动物模型(LI－PILO组)制备：SD大鼠编号后分别称重记录，按3 mEq/kg腹腔注射氯化锂(LiCl)，18～20 h后腹腔注射硫酸阿托品(按照1 mg/kg计算注射用量), 30 min后给予匹罗卡品(按照20 mg/kg计算注射用量)腹腔注射，给药后根据Racine分级观察大鼠的行为学改变，出现4级以上，持续30 min无明显间歇的癫痫持续状态为成功模型。造模成功后按数字表法随机选取发作后6、8、10 h的SD大鼠，予10%的水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉满意后，迅速断头取脑，钝性分离出大鼠的海马组织并保存。(4)正常对照组(NS组)：编号及分组方案同LI－PILO组，在相同时间给予腹腔注射等量生理盐水，两组大鼠在预定时间点处死以行实验。
(1)细胞模型组：Sombati癫痫神经元模型组、Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4、6 h，编号后按照随机数字表法分组；(2)动物模型组：NS组、LI－PILO组(分别为发作后6、8、10 h)，编号及分组方案同细胞模型组。
分别把间歇低氧处理后正常氧培养2、4、6 h的细胞以及动物模型组的标本应用TRIzol法提取总RNA，以适量DEPC水溶解RNA，并取一部分用紫外分光光度仪测算吸光度，确定标本纯度，并根据吸光度(A)值推算标本浓度。应用KAPA通用型一步法SYBR FAST进行real－time PCR测定HMGB1、NR2B mRNA。HMGB1、NR2B及β－actin的基因序列均查自GenBank，引物序列由专业软件Primer5.0设计。HMGB1上游引物序列：5′ATGGGCAAAGGAGATCC－TA 3′，下游引物序列：5′ATTCATCATCATCATCTTCT 3′；NR2B上游引物序列：5′TATGTGTGGCCTCGG－ATGTGT3′，下游引物序列：5′TCTTCCCGTGCTTGCC－ATT3′；β－actin上游引物序列：5′GAAATCGTGCGTG－ACATTA 3′，下游引物序列：5′TAGGAGCCAGGGCA－GTAA 3′。将SYBR、各组RNA、引物及RNase Free H2O分别放入独立的8连管中进行扩增，总反应体系为20 μl。在荧光定量PCR仪(Bio－rad，美国)设定PCR循环参数：42 ℃ 5 min；95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s；60 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，共40个循环，并绘制溶解曲线。实验结果数值以Ct值表示，每处理组至少采用6个来源于不同批次标本的数据进行平均作为该组标本的Ct值，以β－actin为内参，采用2－ΔCt方法计算HMGB1、NMDA相对表达量。
应用SPSS 19.0统计软件。实验数据以
±s表示。数据符合正态分布时，两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析(one－way ANOVA)，组间两两比较采用LSD和S－N－K检验。如果数据不符合正态分布，则采取秩和检验(Kruskal－Wallis test或Kolmogorov－Smirnov tests)的Mann－Whitney U检验对各实验组间进行两两比较统计分析。以P≤ 0.05为差异有统计学意义。
Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4、6 h时，HMGB1 mRNA相对表达量与同一时间点Sombati癫痫神经元组HMGB1 mRNA相对表达量相比均增高，在正常氧培养后4 h时为表达高峰；Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4、6 h时，NR2B mRNA相对表达量分别与同一时间点Sombati癫痫神经元组NR2B mRNA相对表达量相比均增高，在正常氧培养6 h时为高峰(表1)。
细胞模型两组HMGB1、NR2B mRNA相对表达量比较(
±s)
细胞模型两组HMGB1、NR2B mRNA相对表达量比较(±s)
| 组别 | HMGB1 mRNA | NR2B mRNA | |
|---|---|---|---|
| Sombati癫痫神经元模型 | |||
| 2 h | 0.003 29±0.000 28 | 0.006 61±0.000 30 | |
| 4 h | 0.011 34±0.001 67 | 0.006 60±0.000 36 | |
| 6 h | 0.002 67±0.000 15 | 0.011 68±0.000 54 | |
| Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养 | |||
| 2 h | 0.005 01±0.000 54a | 0.008 84±0.000 69b | |
| 4 h | 0.026 76±0.003 75c | 0.012 23±0.000 90d | |
| 6 h | 0.003 52±0.000 33e | 0.029 11±0.000 71f | |
注：与Sombati癫痫神经元模型2 h相比，aP<0.05,bP<0.05;与对照组4 h相比，cP<0.001,dP<0.01；与对照组6 h相比，eP<0.05,fP<0.001；Sombati癫痫神经元间歇低氧后正常氧培养2、4、6 h组间相比，P≤0.001
LI－PILO组在造模成功后6、8、10 h HMGB1 mRNA相对表达量与同一时间点NS组HMGB1 mRNA相对表达量相比均增高，在8 h达高峰；LI－PILO组在造模成功后6、8、10 h NR2B mRNA相对表达量与同一时间NS组NR2B mRNA相对表达量相比均增高，在10 h达高峰(表2)。
动物模型两组HMGB1、NR2B mRNA相对表达量比较(
±s)
动物模型两组HMGB1、NR2B mRNA相对表达量比较(±s)
| 组别 | HMGB1 mRNA | NR2B mRNA | |
|---|---|---|---|
| NS组 | |||
| 6 h | 0.000 03±0.000 02 | 0.165 75±0.003 84 | |
| 8 h | 0.000 03±0.000 02 | 0.167 99±0.005 67 | |
| 10 h | 0.000 03±0.000 02 | 0.165 75±0.003 84 | |
| LI－PILO组 | |||
| 6 h | 0.000 11±0.000 09a | 0.196 12±0.009 41b | |
| 8 h | 0.000 18±0.000 01c | 0.232 11±0.006 27d | |
| 10 h | 0.000 11±0.000 01e | 0.272 48±0.005 84f | |
注：与NS组6 h相比，aP<0.001,bP<0.05;与NS组8 h相比，cP<0.01,dP<0.001；与NS组10 h相比，eP<0.001,fP<0.001；LI－PILO组6、8、10 h相比，P≤ 0.001
近年来，一些研究表明，炎症在癫痫持续状态的病理生理中起关键的作用[8]，有人认为炎症可能诱发癫痫持续状态的发作[9,10]，有人则认为癫痫持续状态是炎症发生的原因[11]，而越来越多的炎症因子，如肿瘤坏死因子(TNF)9、白细胞介素－1(IL－1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在癫痫模型中被发现，越来越多的证据表明，HMGB1作为一种炎症因子[12]，在癫痫持续状态的发病中有重要作用。高迁移率族蛋白B1是一种核蛋白，具有高度保守性，广泛存在于真核细胞内，除了其核表达，HMGB1通过细胞因子、脂多糖(LPS)、缺氧甚至细胞外基质接触刺激细胞，使HMGB1从细胞核输出到细胞质和细胞外，造成细胞损伤[13]。在脑组织中，HMGB1主要在神经元、胶质细胞中表达，活化首先发生在神经元，随后出现于胶质细胞。当缺血性脑损伤后，如癫痫持续状态后，会刺激神经元释放HMGB1，从核浆转位并释放到细胞外，与其受体，如晚期糖基化终产物受体(RAGE)、Toll样受体(TLR)2和4结合后激活核因子－κB(NF－κB)等信号通路促进趋化因子及促炎症因子的释放[14]。
癫痫持续状态导致的神经元损伤可能由兴奋性神经元过度活动有关，而谷氨酸(Glu)是公认的中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，谷氨酸受体分为离子型受体和亲代谢型受体，而N－甲基－D－天门冬氨酸(NMDA)受体是属于谷氨酸受体的离子型受体，对Ca2＋有高度的通透性，NMDA可以调节神经元的存活、树突和轴突的结构发育、突触的可塑性及突触重排等，在神经回路的形成及学习记忆过程中，也起着重要的作用。这类受体被激活后，促进一些阳离子如Na＋、Ca2＋等通过开放的离子通道进入细胞内。NMDA受体被激活后和一些神经系统疾病有关，如：脑缺血、痴呆、帕金森、疼痛、癫痫持续状态等。NMDA受体是由不同的亚单位组成的四聚体或五聚体，编码不同的亚单位，其亚单位共分属3个家族，分别为NR1、NR2和NR3，而NR2又分为4个独立的亚基，即NR2A、NR2B、NR2C和NR2D。NR2B是NMDA受体的一个重要亚基，其介导了神经元兴奋性增高及静息膜电位延长，出现异常的高频率放电，因此NR2B受体在癫痫持续状态中起着重要作用。研究表明，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过神经元激活Toll样受体4(TLR4)，hmgb1－tlr4轴触发中性鞘磷脂酶和Src激酶的活性，与NMDA受体NR2B亚基发生磷酸化，激活NMDA受体，导致细胞内Ca2＋增加，导致癫痫发作和细胞损失[15]。而在脑缺血模型里，增加外源性HMGB1，TNF－α和iNOS表达明显上调，iNOS可以引起神经元去极化及谷氨酸释放[16,17]，激活NMDA受体，造成组织损伤。
本研究发现，HMGB1 mRNA在癫痫持续状态细胞模型组及动物模型组中表达趋势相同，均高于对照组；NR2B mRNA在癫痫持续状态细胞模型组及动物模型组中表达趋势相同，随着时间的延长表达水平升高。其HMGB1 mRNA表达先升高后降低，NR2B mRNA表达随着时间延长而升高，其原因可能为高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通过神经元激活Toll样受体4(TLR4)，触发中性鞘磷脂酶和Src激酶的活性，与NMDA受体2B亚基发生磷酸化，激活NMDA受体，使NR2B逐渐升高；随着时间延长，神经元凋亡或死亡的数量增加，神经元炎性损伤加重，HMGB1分泌会逐渐减少，而NMDA受体被激活后表达呈持续升高，提示可能存在其他相关因素影响NMDA的分泌，需进一步探讨研究HMGB1及NR2B之间的联系，为探索癫痫治疗的有效靶点提供可靠的依据。
