分析同时出现正常条带α2、右缺失(－α3.7)和东南亚缺失(－－SEA)患者基因型和血液学的关系，为临床诊断和遗传咨询提供指导。
回顾性分析2011年8月至2016年8月来中山大学附属第一医院分子诊断室进行地贫基因检测的16 080例患者的临床资料，挑选出同时出现正常条带α2、右缺失(－α3.7)和东南亚缺失(－－SEA)的患者14例(男4例，女9例，胎儿1例)。用XE 4000i血细胞分析仪进行血细胞分析，采用高效液相色谱法(HPLC)定量检测血红蛋白A0(HbA0)、血红蛋白A2(HbA2)和血红蛋白F(HbF)，用跨越断裂点多聚酶链反应(Gap－PCR)技术检测常见的3种缺失型α－地贫，并用反向斑点杂交技术检测17种常见的β－地贫和3种常见的非缺失型α－地贫基因。用两轮巢氏PCR检测HKαα型α－珠蛋白生成性贫血。
16 080份样本中，共检测出HKαα合并东南亚型缺失14例(HKαα/－－SEA)，检出率为0.087%，且存在1个HKαα/－－SEA家系，发现其中1例为罕见的HKαα/－－SEA合并βIVS－Ⅱ－654/βN胎儿病例。HKαα/－－SEA组的平均红细胞体积(MCV)为(69.54±5.92)fl，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)为(22.11±2.22)pg,血红蛋白(Hb)为(117.64±18.14)g/L。与正常组相比，HKαα/－－SEA组的MCV、MCH、Hb明显降低(P<0.05)；与α－地贫杂合子组(－－SEA/αα)相比，MCH、Hb值差异无统计学意义(P>0.05)；与血红蛋白H(HbH)病(－α3.7/－－SEA)组比，HKαα/－－SEA组的MCV、MCH、Hb明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)。
两轮巢式PCR可鉴定HKαα/－－SEA，血液学主要表现为小细胞低色素性贫血，与－－SEA /αα表型类似，但比HbH病轻，能够给临床提供准确的产前诊断和遗传咨询策略。
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α－地中海贫血(简称地贫)是一种遗传性血红蛋白单基因疾病，在我国南方地区发病率较高，主要分为缺失型和非缺失型两类。缺失型主要由东南亚缺失(－－SEA)、右缺失(－α3.7)和左缺失(－α4.2)引起[1]。缺失型α－地贫基因是α珠蛋白基因的1条或2条链由于同源性或非同源性重组的结果。α2和α1球蛋白基因之间的不等价交换可产生单个α－珠蛋白基因的缺失(－α3.7和－α4.2)和对侧重复的α－三联体(αααanti3.7和αααanti4.2)[2,3]。HKαα－等位基因是由－α3.7(右缺失)和αααanti4.2之间不平等交换重排结合而成的一种α－珠蛋白基因簇[4]。HKαα在广西的携带率为0.07%[5]。目前对HKαα的研究较少，仅有少量病例报道[6,7,8,9]，国内尚无对HKαα合并－－SEA缺失型(HKαα/－－SEA)地贫的较为系统的基因型和血液学表型的研究资料。本研究旨在分析广东地区16 080份样本中检测出的14例HKαα/－－SEA血液学和基因学关系，为临床诊断和遗传咨询提供指导。
收集2011年8月至2016年8月我院门诊和住院患者中做地贫基因检测的样本16 080份，检出同时出现正常条带α2、右缺失(－α3.7)和东南亚缺失(－－SEA)的患者14例(男4例，女9例，胎儿1例)，年龄0～56岁。所有受检对象采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA－K2)真空抗凝管抽取静脉血2 ml。
血细胞分析仪(XE 4000i，日本Sysmex公司)，高效液相色谱电泳仪(Bio－Rad Variant Ⅱ，美国)，离心机(Eppendorf 5240，德国Eppendorf公司)，全血基因组DNA提取试剂盒(Quickgene , Fujifilm，日本Kurabo公司)，PCR扩增仪(ABI9700,美国ABI公司)，凝胶成像分析系统(VilberLouramt FUSION FX7，法国VILBER公司)，水平电泳槽及电泳仪(美国Bio－rad公司)，恒温杂交仪(YN－H16，深圳亚能生物公司)。地贫基因检测试剂盒购于深圳亚能生物公司，试剂均为厂家原装配套试剂。
血常规检测用血细胞自动分析仪，主要观察指标为：红细胞血红蛋白量(Hb)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)及红细胞体积分布宽度(RDW)。
用全血基因组DNA提取试剂盒提取全血DNA，采用跨越断裂点PCR技术(Gap－PCR)检测－－SEA/αα、－α3.7/αα、－α4.2/αα 3种常见缺失型α－地中海贫血基因，严格按照试剂盒说明书操作。反应条件是：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。取扩增产物2 μl，在1%琼脂糖凝胶上加样，经120 V电泳1 h，凝胶成像分析系统下观察结果。
采用反向斑点杂交法(RDB)检测3种α－地贫突变的野生型和突变型，包括Hb CS(α142, TAA>CAA)、Hb WS(α122，CAC>CAG)、HbQS(α125，CTG>CCG)。采用RDB法检测17种β－地贫点突变，包括－28、－29、－30、－32、CD14－15、CD17、CD26(βE)、CD27－28、CD31、CD41－42、CD43、CD71－72、IVS－Ⅰ－1、IVS－Ⅰ－5、IVS－Ⅱ－654、CAP＋1、initiation condon。α－地贫点突变和β－地贫点突变的扩增参数为50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。PCR结束后取扩增产物进行反向斑点杂交，观察膜条显色结果，判断基因型。参考文献[4,10,11]设计HKαα及αααanti4.2的引物序列，引物由华大基因公司合成。
第一轮PCR体系包括脱氧核苷三磷酸(dNTP) 750 μmol/L，LA缓冲液(LA buffer) 3 μl，GC－melt缓冲液0.3 mol/L，正反向引物各4.8 pmol/L，LA Taq核酸聚合酶(LA Taq DNA Polymerase) 0.1 U，基因组DNA(gDNA) 100 ng，其余用灭菌水(ddH2O)补齐，总体积为30 μl。取扩增产物2 μl，在1%琼脂糖凝胶上加样，经120 V电泳1 h，凝胶成像分析系统下观察结果。第二轮PCR扩增模板为第一轮PCR产物稀释10倍，反应体系包括第1轮PCR产物1 μl、GC缓冲液I 15 μl，正反向引物各4.8 pmol/L，dNTP 750 μmol/L，HotStar热启动核酸聚合酶(HotStar Taq DNA Polymerase) 0.1 U，gDNA 100 ng，其余用灭菌水(ddH2O)补齐，总体积为30 μl。取2 μl产物用1.5%凝胶糖进行凝胶电泳。
使用SPSS 23.0统计学软件对数据进行统计学分析。正太分布计量资料用
±s表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料采用百分率(%)表示。P<0.05为差异有统计学意义。
16 080份样本中发现14份阳性结果，同时出现正常条带α2、右缺失(－α3.7)和东南亚缺失(－－SEA)的条带，检出率为0.087%(图1)。
M：标准带；1：正常条带αα/αα(1 826 bp)；2 ：－－SEA/αα(1 306 bp)；3：－α3.7/αα(2 051 bp)；4：－α4.2/－－SEA；5：－α3.7/－α4.2；6：－α3.7/－－SEA；7：HKαα/－－SEA
14例HKαα/－－SEA患者中，检测出1例为HKαα/－－SEA同时复合654杂合子，见表1。
14例HKαα/－－SEA地贫的基因型分布和血液学分析
14例HKαα/－－SEA地贫的基因型分布和血液学分析
| 例序 | 性别 | 年龄(岁) | 血液学指标 | 基因型 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Hb(g/L) | MCV(fl) | MCH(pg) | RDW | HbA2(%) | ||||
| 1 | 男 | 31 | 123 | 65.1 | 20.4 | 0.14 | 2.7 | HKαα/－－SEA |
| 2 | 女 | 33 | 128 | 68.93 | 21.49 | 0.14 | 2.6 | HKαα/－－SEA |
| 3 | 女 | 26 | 121 | 61.6 | 24.6 | 0.17 | 3.3 | HKαα/－－SEA |
| 4 | 男 | 38 | 130 | 77.92 | 21.22 | 0.18 | 3.2 | HKαα/－－SEA |
| 5 | 胎儿 | 0 | 123 | 92.6 | 29.4 | 0.17 | 0.0 | HKαα/－－SEA |
| 6 | 女 | 31 | 106 | 64.82 | 21.52 | 0.16 | 2.4 | HKαα/－－SEA |
| 7 | 女 | 23 | 118 | 69.4 | 21.9 | 0.15 | 2.3 | HKαα/－－SEA |
| 8 | 女 | 22 | 100 | 59.1 | 17.3 | 0.22 | 2.5 | HKαα/－－SEA |
| 9 | 女 | 30 | 124 | 66.8 | 21.3 | 0.14 | 2.5 | HKαα/－－SEA |
| 10 | 男 | 29 | 136 | 77.2 | 21.4 | 0.17 | 2.6 | HKαα/－－SEA |
| 11 | 女 | 34 | 114 | 71.24 | 21.93 | 0.15 | 2.8 | HKαα/－－SEA |
| 12 | 女 | 56 | 67 | 74.5 | 24.5 | 0.21 | 2.2 | HKαα/－－SEA |
| 13 | 女 | 25 | 116 | 75.6 | 24 | 0.15 | 4.2 | HKαα/－－SEA，βIVS－Ⅱ－654/βN杂合 |
| 14 | 男 | 40 | 141 | 71.8 | 25.9 | 0.13 | 2.9 | HKαα/－－SEA |
注：Hb：血红蛋白；MCV：平均红细胞体积；MCH：平均红细胞血红蛋白量；RDW：红细胞体积分布宽度；HbA2：血红蛋白A2；Hb参考值：120～160 g/L(男)，110～150 g/L(女)；MCV参考值：80～95 fl；MCH参考值：27～32 pg；RDW参考值：0.12～0.15；HbA2参考值：2.5%～3.5%
两轮巢氏PCR检测HKαα，在第一轮采用L－anti4.2－F/L－3.7R引物扩增得到约4 500 bp的片段(图2A)，第二轮以稀释10倍的第一轮PCR产物为模板，分别用3.7F/3.7R和anti4.2F/anti4.2R引物进行扩增后，得到－α3.7和anti4.2片段(图2B，图2C)。
14例HKαα/－－SEA地贫的基因型分布和血液学分析见表1。
其中病例5为胎儿，未计入统计范围。以21例基因检测结果为阴性的正常体检人群的血液学指标检测结果作为正常对照组，分别和24例α－地贫杂合子1组(－－SEA/αα)、19例HbH病组(－α3.7/－－SEA)比较，各基因型的血液学指标检测结果显示，HKαα/－－SEA 、－－SEA/αα和HbH病的血液学指标MCV、MCH、Hb均比正常对照组低，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。HKαα/－－SEA的血常规表现为小细胞低色素性，但贫血症状较轻或无贫血，其Hb、MCH与－－SEA/αα相比，差异无统计学意义(P>0.05)，而MCV与－－SEA/αα相比，差异有统计学意义(P<0.05)，临床症状与－－SEA /αα类似，但比－α3.7/－－SEA轻。与HbH病(－α3.7/－－SEA)组比，HKαα/－－SEA组的MCV、MCH、Hb明显升高(P<0.05)，见表2。
4种基因型血液学指标特点比较分析
4种基因型血液学指标特点比较分析
| 基因型 | 例数 | 血液学指标 | ||
|---|---|---|---|---|
| MCV(fl) | MCH(pg) | Hb(g/L) | ||
| HKαα/－－SEA | 13 | 69.54±5.92 | 22.11±2.22 | 117.64±18.14 |
| －－SEA/αα | 24 | 65.34±2.91 | 21.22±0.92a | 122.33±11.31a |
| HbH(－α3.7/－－SEA) | 19 | 61.53±6.72b | 18.45±1.98b | 85.55±14.41b |
| αα/αα | 21 | 91.36±2.42c | 30.48±0.95c | 144.90±7.88c |
注：aHKαα/－－SEA组与α－地贫杂合子1组(－－SEA/αα)比较，P>0.05；bHKαα/－－SEA组与HbH病组(－α3.7/－－SEA)比较，P<0.05；cHKαα/－－SEA组与正常对照组(αα/αα)比较，P<0.05
人类珠蛋白链是由2条α肽链和2条β肽链组成的四聚体，其中α肽链包括ζ－链和α－链。合成α珠蛋白链的基因位于16号染色体末端的α－珠蛋白基因簇，其功能基因包括ζ－α2－α1基因成员的7个位点[12]：5，－ζ－ψζ1－ψα2－ψα1－α2－α1－θ。α－地中海贫血主要是α－珠蛋白基因缺失引起，依功能缺陷情况可分为α0－地贫和α＋－地贫。常见的α＋－地贫主要由α－珠蛋白基因簇同源序列不等价交换引起。α－基因有X、Y、Z 3个同源盒，被非同源区域间隔[2,3]。2个Z同源盒间距为3 700 bp，发生于Z同源盒的重组可使1条染色体缺失了3 700 bp(－α3.7)，另1条则形成α三联体(αααanti3.7)；而发生于X同源盒(间距为4.2 kb)的重组，不等价交换后则使1条染色体缺失4.2 kb(－α4.2)，另1条形成αααanti4.2。HKαα便是由－α3.7和αααanti4.2不等价交换形成[4,13,14]。本研究对14份含－α3.7、α2、－－SEA3条罕见缺失条带的样本进行了两轮巢氏PCR扩增，均检测出αααanti4.2条带，因此这14份样本均为HKαα合并东南亚型缺失(HKαα/－－SEA)，而对于HbH病(－α3.7/－－SEA)，却未检测到αααanti4.2条带。
在本研究中，13例HKαα/－－SEA表现为小细胞低色素性(MCV<80 fl，MCH<27 pg)，临床表型与α－地贫杂合子1组(－－SEA/αα)相似，但比HbH病轻，这一结果与Shang等[5]、姚亚超等[8]、Wu等[12]研究结果一致。我们检测到1例HKαα/－－SEA合并654杂合病例，其表型与轻型β－地贫类似(MCV<80 fl，MCH<27 pg，HbA2>3.5%)，与Wang等[4]结果一致。此外，检测出1个HKαα/－－SEA的家系，其母亲基因型为HKαα，父亲基因型为－－SEA，胎儿基因型为HKαα/－－SEA。HKαα的基因有正常的α2基因和1个由α2/α1部分片段组成的融合基因，所以当HKαα合并SEA杂合时，临床症状要明显轻于HbH病(－α3.7/－－SEA)，可以选择保住胎儿。将情况告知该夫妇后，其选择继续妊娠。
Wu等[15]的研究显示广东地区HKαα患者的携带率为0.03%，而我们在16 080份样本中，检测出HKαα合并东南亚型缺失14例(HKαα/－－SEA)，检出率为0.087%，检出率稍高，但也是一个很低的携带率，因此，尚无必要展开大规模人群的HKαα筛查。只是对夫妻双方有一方是α0，另一方是静止型地贫(－α3.7/αα或－α4.2/αα)时，其后代有25%的机会为HbH(－－/－α)病。而HbH常表现为中间型贫血，有的患儿甚至需要予以输血治疗[16]。而检出－α3.7/αα的条带时，实际基因型别可能为－α3.7/αα或HKαα，合并SEA时有可能将HKαα/－－SEA误诊断为HbH(－α3.7/－－SEA)，做出不正确的产前咨询[15]。
综上所述，14例HKαα合并东南亚型缺失地贫(HKαα/－－SEA)主要表现为轻型α－地贫症状，与－－SEA/αα临床表型类似，比HbH病(－α3.7/－－SEA)轻。当HKαα/－－SEA合并β－地贫时临床表型与轻型β－地贫类似。在产前诊断中，尤其要注意HKαα/－－SEA的检测，为临床提供准确的产前诊断和遗传咨询。
