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艰难梭菌是一种革兰阳性、产毒素或非产毒素的厌氧芽胞杆菌。该菌主要通过粪－口途径传播，感染症状从轻度腹泻到危及生命的伪膜性结肠炎，总体病死率为6%，老年患者升至13.5%[1]。艰难梭菌芽孢对消毒剂如乙醇、肥皂、高温和干燥有很强的抵抗力，可以在物体表面存活数月到数年，利于其传播。一般认为艰难梭菌感染(CDI)与抗菌药物的应用及住院史有关，应用抗菌药物可导致嗜酸粒细胞减少，是CDI的主要危险因素[2]。然而，部分CDI患者与近期抗菌药物接触史无关，而应用质子泵抑制剂和运动障碍均可诱发微生态失调而致CDI[3,4]。由于人类微生物项目和欧洲人类肠道宏基因组计划(MetaHIT)的推动，许多专家研究了人类健康和疾病与微生物群之间的关系，尤其是专注于研究维持和抵抗艰难梭菌定植的肠道微生物群的代谢活动，以及抗菌药物如何改变肠道微生物群导致艰难梭菌易感性。本文就CDI和肠道微生物群之间的关系，从代谢的角度探讨CDI感染机制以及最新的防治方案，以期发现新的治疗靶点。
人类微生物群是居住在体内和体表的复杂微生物群落。肠道微生物群占人类微生物群的70%，其中远端肠道中最多。在分离培养技术出现之后，研究估计人类肠道中至少有1 800个属、高达1.5万～3.6万种微生物。90%～99%的健康人类和动物肠道微生物群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成，其余的一小部分由变形菌门、放线菌门、疣微菌门和蓝菌门组成。其中，厚壁菌门占结肠细菌群落的50%～70%以上，尤其是毛螺菌科和瘤胃球菌科[2]。
微生物群在人类健康和疾病中发挥关键作用，从而促使人们去探索这一共生群落的结构特征和功能。健康人群中的微生物多样性受到饮食、环境、遗传和早期接触微生物的影响。肠道微生物群可以为宿主提供许多好处，如它们赋予抗菌性，形成宿主免疫应答，并参与重要的代谢转化。厚壁菌门，尤其是梭菌属的成员具有降解多糖和氨基酸发酵的能力；拟杆菌门的许多成员具有分解宿主聚糖和不易消化的碳水化合物，尤其是分解抗性淀粉和植物细胞壁多糖的能力[5]；厌氧微生物可将复合碳水化合物和氨基酸发酵成对肠道健康很重要的短链脂肪酸(SCFA)，其中丁酸盐在调节宿主基因表达、炎症、分化和凋亡中起重要作用[6,7]。肠道微生物群的成员也在脂质或胆汁酸代谢中发挥关键作用。
抗菌药物对肠道微生物群的结构和功能有深远的影响。根据抗菌药物的作用机制，不同抗菌药物对肠道微生物群有不同的影响。为了明确肠道微生物群在CDI中的作用，Schubert等[8]将小鼠用不同的抗菌药物诱导产生不同的生物群落，随后将这些经抗菌药物作用的小鼠进行CDI实验，并鉴定出与疾病相关的群落变化模式。结果证明了埃希菌属和链球菌可诱发CDI，而紫单胞菌科、毛螺菌科和乳杆菌科对CDI有防护作用。克林霉素预处理的叙利亚仓鼠对艰难梭菌敏感，易感性与肠道中的拟杆菌门和厚壁菌门的显著减少和变形菌门的显著增加有关[9]。用广谱第三代头孢菌素头孢哌酮预处理的小鼠死于CDI，并且导致肠道微生物群产生持久性变化[10]。这些研究表明，抗菌药物处理后的小鼠对CDI的敏感性与细菌多样性的减少有关，且没有一种单一的物种可独立地介导外来细菌的定植抗力。
关于人类的抗菌药物、肠道微生物群和CDI之间相互作用的研究极为有限。大多数涉及人类的研究使用粪便微生物群作为肠道微生物群的代表，因为样品易于获得。2013年Antharam等[11]的一项研究比较了健康受试者(n＝40)和抗生素相关性腹泻(AAD)者(n＝36)与CDI(n＝39)患者的粪便微生物群，结果发现，与健康对照相比，AAD和CDI患者的粪便微生物群中细菌多样性和物种丰度降低，其中瘤胃球菌科和毛螺菌科以及来自梭菌聚类Ⅳ和ⅩⅣa亚群减少。另一项研究综合了来自338例患者的微生物组、临床和人口统计学数据结果，相对于健康对照组和非CDI腹泻对照组，CDI腹泻组富集了肠球菌科、肠杆菌科、韦荣球菌科和毛螺菌科。而对照组富集了类杆菌科、毛螺菌科、紫单胞菌科和瘤胃菌科[12]。此外，关于哪些微生物在CDI中起促进作用，还需要进行大规模的研究。
细菌孢子与环境中特定的小分子(发芽剂)相互作用可促使孢子萌发。在芽孢杆菌属中，孢子内膜上含有许多的发芽剂受体。发芽剂－受体相互作用引起孢子核心的轻微水合，导致单价阳离子(例如Na＋、K＋、H＋)的快速释放，随后释放吡啶酸钙(Ca－DPA)，之后激活皮层裂解酶降解皮层，促使营养细胞的生长。在艰难梭菌中，钙离子是一种发芽信号，可激活枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(CspB)，随后激活艰难梭菌孢子萌发所必需且唯一的皮层裂解酶——SleC。因此，肠钙吸收差的个体(例如维生素D缺乏、使用质子泵抑制剂)更容易发生CDI[13]。
初级和次级胆汁酸的相对浓度是艰难梭菌孢子萌发和生长的关键信号，初级胆汁酸如牛磺胆酸(TA)和胆酸(CA)诱导孢子萌发，而次级胆汁酸如脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)抑制营养细胞的生长和毒素表达[14]。小鼠实验表明，孢子萌发主要发生在小鼠回肠内，而艰难梭菌的生长位于大肠内[15]。抗菌药物改变了肠道微生物群结构，尤其是减少了能够将初级胆汁酸解离和脱羟基化成次级胆汁酸的细菌，次级胆汁酸代谢的丧失和肠道微生物群的竞争促使艰难梭菌生长、毒素生成和发病[16]。
肠道微生物群成员具有不同的代谢需求，能够竞争各种营养。艰难梭菌的生长需要氨基酸(半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸)和维生素(生物素、泛酸盐和吡哆醇)[17]。此外，艰难梭菌能够发酵碳水化合物，包括果糖、葡萄糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、山梨糖醇和唾液酸[18]。拟杆菌属具有唾液酸分解代谢操纵子，能够使黏膜上的碳水化合物释放唾液酸。在正常状态下，共生细菌消耗唾液酸，使其在肠道中保持低水平。然而，应用抗菌药物增加了大肠中的唾液酸浓度，艰难梭菌可利用唾液酸而促进其自身生长[14]。除此之外，抗菌药物改变肠内碳水化合物的厌氧发酵，导致SCFA减少，从而引发艰难梭菌的定植。肠道中SCFA的丢失可能和pH值的增加有关，但是关于SCFA如何改变艰难梭菌定植，尚未开展广泛研究[2]。另一方面，艰难梭菌的定植抗力可由梭菌C. scindens介导，后者可将初级胆汁酸向次级胆汁酸转化，而抑制艰难梭菌之营养细胞的生长[19]。某些益生菌(主要是双歧杆菌和乳杆菌)在体外抑制艰难梭菌对肠上皮细胞或肠黏液的黏附并且产生抗菌物质抑制艰难梭菌生长[20]。
CDI主要由两种糖基化毒素TcdA、B介导，TcdA、B使Rho家族的GTP酶失活。许多高毒力艰难梭菌，例如BI/NAPI/027型，表达二元毒素，是一种ADP核糖基化毒素。最近的研究显示这种毒素通过间接诱导嗜酸粒细胞凋亡来破坏宿主先天免疫应答[21]。
艰难梭菌毒素表达受肠道中的丁酸盐、葡萄糖和其他碳源等多种营养物质的调节。丁酸盐是毒素合成的激活剂，氧化还原应激和营养物质的缺乏促进丁酸盐的产生，但尚不清楚丁酸盐激活毒素合成的分子机制。丁酰CoA是丁酸盐和丁醇的前体，是毒素合成的抑制剂。因此，探索细菌如何调控丁酰CoA转化为丁酸盐或丁醇，将为调控艰难梭菌毒素表达提供新的靶点。培养基中补充葡萄糖时可抑制艰难梭菌毒素的表达。乳糖阻遏蛋白CcpA调控葡萄糖对毒素合成的抑制作用，但葡萄糖的缺乏并不促进毒素的表达。CcpA直接或间接控制大量的调节蛋白，并与其他调节蛋白(如Cody和Rex)一起参与对细菌新陈代谢和毒力的调控。此外，培养基中补充脯氨酸和半胱氨酸等也会抑制毒素的表达。因此，详细了解氨基酸代谢途径及其调控可能为艰难梭菌的发病机制提供重要线索[22]。有文献报道，CDI与非CDI腹泻对照组相比，有六种代谢物在CDI患者中含量丰富，包括leonuriside A、N－棕榈酰谷氨酸、根皮苷、两种三肽和神经酰胺，而胆碱和乙酰吗啡含量较低，表明艰难梭菌毒素表达需要独特的生理代谢环境[23]。
患者在经抗菌药物治疗8周内出现腹泻，要高度警惕CDI。病情轻到中度者，主要症状是腹泻，呈伴有恶臭气味的水样稀便；偶有便血。中重度者通常伴有全身症状，如腹部绞痛、发热(高达40 ℃)、白细胞增多(高达50×109/L)和低白蛋白血症(<25 g/L)[24,25]。此外，影像学检查有助于早期诊断。腹部平片可显示息肉样黏膜增厚、"拇指印" (与横纹皱褶增厚相关的宽横纹带)或结肠的气体扩张(肠梗阻)。CT最常用于评估CDI的严重程度。常见的CT表征为肠壁增厚、"手风琴征" 、"双晕征" 、结肠周围条纹征和腹水，也曾报道过伴有囊样肠积气[26]。
CDI的实验室检测方法包括厌氧培养、产毒素培养、毒素A和毒素B的酶免疫分析(EIA)、谷氨酸脱氢酶(GDH)检测、细胞毒性中和试验(CCNA)及核酸扩增试验(NAAT)。但上述方法各自存在局限性。美国医疗保健流行病学协会(SHEA)指南曾认为，将GDH与毒素检测相结合的两步法是最佳方法。GDH试验进行初步筛查，可以快速鉴定出阴性样本，从而将更昂贵的NAAT检测限制在GDH阳性的样本中[24]。
CDI伴有肠道炎症。目前发现的炎症生物标志物包括细胞因子、钙卫蛋白和粪乳铁蛋白[27]。这些生物标志物并不具有特异性，但可反映疾病的严重程度[28]。例如，钙卫蛋白是在中性粒细胞的细胞质中发现的一种蛋白质，炎症性肠病和感染性腹泻时，可以在粪便中检测到[28,29]。尽管粪便钙卫蛋白在CDI时的敏感性较低(38.5%)，但其对预测CDI复发的特异性为91.9%，因此可为合理治疗CDI提供有价值的信息[29]。CDI的严重程度与粪便中的乳铁蛋白水平显著相关，故粪便乳铁蛋白已被用于评估感染性腹泻和炎症性肠病[27]。
Anikst等[30]建议应采取措施避免不必要的艰难梭菌检测，以减少CDI的过度诊断，因此开发特异性生物标志物尤为重要。
抗菌药物的应用治愈了很多严重的感染性疾病，卓有成效地降低了病死率，进而掀起了抗菌药物的研发和广泛应用的高潮。然而抗菌药物的滥用已经发展成为一个影响全民健康和用药安全的社会问题。因此，对于抗菌药物的使用应针对病情合理用药。
当在积极治疗原发病的同时，应尽量避免如克林霉素等容易诱发CDI的抗菌药物。临床医生应根据患者病情给出个体化的抗菌药物治疗方案。如必须应用易诱发CDI的抗菌药物时，要充分考虑到用药后的利与弊，应注意抗菌药物的用量和治疗时间，在给予患者抗菌药物治疗的同时尽量补充足够的益生菌使肠内菌群平衡，将CDI的概率降到最低，保证患者的生命安全，一旦出现CDI的临床症状应立即停用。而实际上有时因治疗原发感染的需要不能停用易致CDI的抗菌药物，则必须统筹兼顾，多管齐下，为患者制定一个较合理的治疗方案。
目前，已有多种抗微生物制剂用于治疗CDI。万古霉素和甲硝唑是所有治疗中的金标准。甲硝唑是轻中度CDI治疗的首选方法，而中重度CDI则推荐万古霉素。然而，万古霉素和甲硝唑会引起肠道正常菌群的破坏而导致CDI复发。还有人担心万古霉素的使用可能会促进万古霉素耐药肠球菌(VRE)的肠道定植[1]。
非达霉素是一种不易被吸收的大环内酯类抗菌药物，对艰难梭菌有杀菌活性，但对其他革兰阳性细菌的活性有限[31]。非达霉素对结肠微生物群破坏较轻，并且对许多VRE菌株具有抗菌活性。考虑到非达霉素的确切作用和成本效益，一般建议应用于复发(高龄和严重CDI)的患者以及感染非高毒力菌株的患者[32]。
除以上介绍的几种抗菌药物以外，还有一些正在进行临床试验的新药也具有较好的效果。如新型苯并咪唑类药物SMT 19969、CRS 3123和LFF 571。SMT 19969是一种新型、窄谱，不可吸收的抗菌药物。体外实验显示其对艰难梭菌生长和细胞毒素表达有抑制作用[33]。临床Ⅰ期试验结果表明，SMT 19969安全，耐受性良好，可重复给药；并且该药对肠道正常微生物群损害较轻，因此可能会降低CDI复发率。目前正在招募患者，进行Ⅱ期随机、双盲临床研究，以比较其与万古霉素的疗效。CRS3123是抑制细菌甲硫氨酰－tRNA合成酶的口服药物，对艰难梭菌和需氧革兰阳性细菌具有很强的活性，但对革兰阴性细菌(包括厌氧菌)的活性较弱。目前临床Ⅰ期试验结果表明CRS 3123耐受性良好，可进一步研究其对CDI的疗效[34]。LFF 571是一种新型的半合成硫肽，通过高亲和力结合到蛋白质合成延长因子Tu而抑制细菌生长。LFF 571对艰难梭菌(尤其是高毒株BI/NAPI/027)以及其他革兰阳性细菌具有很强的抗菌活性，但对厌氧的革兰阴性细菌活性有限。目前正在进行临床Ⅱ期研究[35]。
粪菌移植(FMT)已被用于重建正常结肠菌群的治疗方法。来自健康供体的粪便经适当过滤，经鼻胃管、灌肠或结肠镜检查后注入到患有复发性疾病患者的结肠中。FMT的理想受体是18岁以上、复发性CDI或抗菌药物治疗失败的患者。进行FMT所必需的复发感染次数仍然有待确定，但最近的研究表明，FMT适用于进行标准治疗的患有3次或更多次CDI的患者，或口服万古霉素治疗1周以上无反应的中度CDI患者，或口服万古霉素治疗48 h后无反应的严重CDI患者。免疫功能低下的患者通常不能进行FMT治疗，因为会增加不良反应的风险[1]。
尽管FMT对复发性CDI患者的成功率>90%，但这种治疗机制尚不清楚[36]。研究人员探讨了FMT如何改变复发性CDI患者粪便微生物群的结构，发现在成功移植后，粪便微生物群中拟杆菌门增多，变形菌门减少[37,38]。多项研究表明，通过恢复肠道微生物群来恢复次级胆汁酸水平有助于恢复人类对艰难梭菌的定植抗力[39]。但控制次级胆汁酸水平也是重要的考虑因素，如DCA，因为太多的DCA会增加结肠癌的风险[2]。
总之，FMT是一种具有高潜力的治疗方案。与抗菌药物治疗和反复住院治疗相比，FMT的成本可能会较低。然而，由于缺乏对FMT作用机制的了解、对不良事件的关注，并且缺乏标准化治疗方案，因此这种治疗策略仍需改进[40]。
肠道病原体通过毒力改变肠道代谢环境，但宿主饮食是改变这种环境利于健康肠道生态系统的有希望的途径[41]。有研究报道，在小鼠模型中，膳食Zn的过量摄入可通过增加毒素活性和改变宿主免疫应答而严重加剧CDI，而低蛋白饮食对CDI小鼠有保护作用[42,43]。其他研究显示通过艰难梭菌与双歧杆菌共培养，或在复杂的粪便微生物存在下，微生物相关碳水化合物(MAC)对艰难梭菌有抑制作用[20]。MAC存在于植物多糖中，是构成膳食纤维、肠微生物群的主要燃料，低MAC饮食导致肠微生物群产生SCFA的量不足[44]。在缺乏MAC的情况下，导致远端结肠上的黏液变薄，微生物与上皮的接近程度增加并且炎症标志物表达增加[45]。这些观察结果表明，肠微生物群的可塑性和代谢灵活性已被饮食摄入所改变。然而，艰难梭菌与以MAC为中心的微生物群的相关性仍有待于确定。
CDI的一般措施包括停止不必要的抗菌药物治疗、积极液体复苏以及避免质子泵抑制剂等消化系统类药物的使用。基于最近的欧洲临床微生物学和传染病学会更新的建议，根据CDI的严重程度和不同的危险因素，给出了不同的治疗方案，包括免疫治疗、手术治疗等，并且应每天观察治疗效果，如患者治疗后病情未恶化，应至少3 d后进行评估[46]。
CDI的发生率和严重程度不断增加，复发性CDI更是重大的医学难题。传统治疗药物如甲硝唑和万古霉素的局限性(在治疗CDI的同时也会破坏正常肠道菌群，并诱导耐药菌的产生)，催生了新药物的研发和治疗方式的转变。CDI与肠道微生物群的改变有关，然而，很少有研究表明它们之间的内在联系。因此，探索在疾病和非疾病条件下艰难梭菌与微生物群和宿主之间的相互作用对于更好地了解该菌株的传播和发病机制至关重要。深入研究艰难梭菌在不同感染阶段微生物群的独特代谢作用，可为开展微生物或分子靶向治疗奠定基础，从而破坏或重建与疾病和健康相关的代谢网络，进而对CDI进行更好的预防和治疗。
