探讨α7亚单位N型乙酰胆碱受体(α7nAChR)介导的胆碱能抗炎通路在低强度迷走神经刺激(LL－VNS)抑制心房颤动(房颤)中的作用。
18只健康比格犬按随机数字表法分为假手术组(n＝6)、LL－VNS组(n＝6)和MLA(α7nAChR竞争性拮抗剂)＋LL－VNS组(n＝6)。所有犬右心房刺激(800次/min)6 h，连续刺激3 h后，假手术组给予心房神经节(GP)注射生理盐水、LL－VNS组给予GP注射生理盐水加LL－VNS、MLA＋LL－VNS组给予GP注射MLA加LL－VNS。所有犬每小时末监测心房及肺静脉有效不应期(ERP)和房颤诱发情况，分别于基线期、3 h末、6 h末采集静脉血检测白细胞介素－6(IL－6)、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)和乙酰胆碱(ACh)水平，实验结束后取心房组织检测IL－6、TNF－α、ACh和核转录因子－κBp65(NF－κBp65)及转录激活子3(STAT3)蛋白表达情况。
右心房刺激3 h后，3组犬心房及肺静脉ERP显著缩短，房颤诱发率和时间增加。3～6 h，假手术组和MLA＋LL－VNS组心房及肺静脉ERP持续缩短，房颤诱发率和时间增加。LL－VNS组3 h后ERP逐渐延长，实验终点房颤诱发率和时间与3 h相比明显缩短(P<0.05)。6 h后LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组血清中炎性因子水平显著低于假手术组(pg/ml)[IL－6：(101±6)比(119±7)，P<0.05；(102±5)比(119±7)，P<0.05；TNF－α：(17.8±1.7)比(22.1±2.0)，P<0.05；(17.9±2.2)比(22.1±2.0)，P<0.05]，血清ACh水平高于假手术组(μg/ml)[(151±13)比(123±10)，P<0.05；(145±5)比(123±10)，P<0.05]。LL－VNS组心房组织炎性因子水平明显低于另两组，LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组心房组织中ACh水平明显高于假手术组。LL－VNS组心房组织NF－κBp65蛋白水平明显低于假手术组和MLA＋LL－VNS组(P<0.05)，STAT3蛋白水平高于另两组(P<0.05)。
LL－VNS可抑制心房肌电重构及房颤的诱发和维持，其机制可能与α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路有关。
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迷走神经是体内自主神经的重要组成部分，其张力的变化与心房颤动(房颤)的发生密切相关。研究发现低强度迷走神经刺激(low－level vagus nerve stimulation，LL－VNS)可抑制房颤的发生和维持[1,2,3]，然而其调节机制尚未完全阐明。大量研究证实炎性因子的水平与房颤的关系密切，炎性因子可导致心房肌电重构和结构重构[4,5,6,7,8]，有利于房颤的发生和维持。迷走神经释放的递质乙酰胆碱通过激活α7亚单位的N型乙酰胆碱受体(α7nAChR)起到抑制血清及组织中炎性因子水平[9]的作用，此过程称为胆碱能抗炎通路(cholinergic anti－inflammatory pathway，CAP)，然而LL－VNS对房颤的抑制作用与CAP激活的关系尚不明确。本研究通过制备急性房颤模型，同时给予LL－VNS及阻断CAP后给予LL－VNS，观察α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路在LL－VNS抑制房颤中的作用。
健康成年雄性比格犬18只，体质量8～10 kg(购自北京玛斯生物技术有限公司)。
LEAD7000心电生理监测仪(四川锦江电子科技有限公司)，正压通气辅助呼吸机(美国Harvard Apparatus Holliston公司)，离心机(德国Beckman Coulter公司)，α7nAChR拮抗剂methyllycaconitine(MLA，美国Abcam公司)，犬白细胞介素6(IL－6)酶联免疫试剂盒、犬肿瘤坏死因子α(TNF－α)酶联免疫试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，乙酰胆碱(ACh)酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所)，免疫组织化学一抗：NFκBp65抗体、STAT3抗体(美国Abcam公司)，免疫组织化学二抗：羊抗兔IgG荧光二抗(美国ASPEN公司)。
18只比格犬按随机数字表法分为3组，假手术组、LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组，每组6只。所有犬均行6 h右心房800次/min快速起搏，假手术组进行单纯6 h右心房起搏并在第3小时末于4个心房神经节(GP)注射生理盐水(0.5 ml/GP)，LL－VNS组前3 h右心房起搏，第3小时末于4个GP注射等量生理盐水，3～6 h右心房起搏的同时行LL－VNS，MLA＋LL－VNS组3 h右心房起搏后分别于4个GP注射等量MLA(0.5 mg/GP)，3～6 h右心房起搏和LL－VNS。
所有实验犬均行3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉(根据动物反应每30～60分钟静脉追加戊巴比妥钠50 mg)，后行气管插管，机械通气，连接体表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ导联监测心电图。左右侧第4肋间开胸，打开心包，充分暴露心脏，分别于左心房(LA)、右心房(RA)、左上肺静脉(LSPV)、右上肺静脉(RSPV)缝制多级电极，通过LEAD7000电生理仪记录和分析。LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组钝性分离左侧颈部迷走神经干，用银质双极电极钩挂迷走神经，液体石蜡保湿，固定备用。
所有比格犬行6 h右心房快速起搏(800次/min，刺激电压为2倍起搏阈值)，每小时监测心房和肺静脉有效不应期(ERP)，方法同前[10]，短阵快速刺激左心耳(500、600、800次/min，各3次)，监测房颤诱发情况(房颤定义为持续5 s以上快速不规则的心房激动)。假手术组和LL－VNS组第3小时分别于右上、右下、左上、左下4个GP注射0.5 ml生理盐水，LL－VNS组进行低强度迷走神经刺激(20 Hz，0.1 ms)3 h，刺激电压为引起心率下降20%阈电压的50%，MLA＋LL－VNS组第3小时于4个GP注射等量MLA(0.5 mg/GP)，进行3 h LL－VNS。
所有实验动物在实验基线期、3 h、实验终点分别取静脉血4 ml放入EDTA试管中，立即低温下离心(3 000 r/min，15 min)，取上清液1～2 ml放入冷冻管中，保存于－80 ℃冰箱。血清中TNF－α、IL－6和ACh等指标采用ELISA方法检测，在实验终点低温下剪取左、右心房肌组织－80 ℃保存待检。ELISA方法检测TNF－α、IL－6和ACh水平。
将胶片结果进行扫描存档，用AlphaEase FC凝胶图像分析软件分析目标带的吸光度(A)值。
取左、右心房组织及右前GP组织采用免疫荧光染色方法检测α7nAChR蛋白的定位表达。
应用SPSS 22.0统计软件处理数据，计量资料采用
±s表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
右心房刺激3 h后，3组RA、LA、RSPV、LSPV的ERP显著缩短(P<0.05)。假手术组和MLA ＋LL－VNS组RA、LA、RSPV、LSPV的ERP在心房刺激3 h后持续缩短，第6小时与基础状态相比明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05); LL－VNS组LL－VNS后RA、LA、RSPV、LSPV的ERP逐渐延长(P<0.05)，6 h后，ERP较同组3 h明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；明显高于假手术组和MLA＋LL－VNS组，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。
注：与同组基线期比较，aP<0.05；与同组3 h比较，bP<0.05；与同时间点假手术组比较，cP<0.05；与同时间点MLA＋LL－VNS组比较，dP<0.05
右心房刺激3 h后，3组房颤诱发平均持续时间显著延长，3组的房颤诱发率明显高于基础状态(P<0.05)。LL－VNS组6 h房颤诱发平均持续时间及诱发率明显低于同组3 h、同时间点假手术组及MLA＋LL－VNS组(P<0.05)。MLA＋LL－VNS组6 h后房颤诱发平均持续时间和房颤诱发率与同组3 h及假手术组6 h相比差异无统计学意义(图2)。
注：与同组基线期比较，aP<0.05；与同组3 h比较，bP<0.05；与同时间点假手术组比较，cP<0.05；与同时间点MLA ＋LL－VNS组比较，dP<0.05
右心房刺激3 h后，3组血清炎性因子(IL－6、TNF－α)水平升高(P<0.05)，ACh下降(P<0.05)。6 h后，假手术组炎性因子水平持续升高，LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组下降，与同组3 h比较差异有统计学意义(P<0.05)。6 h后LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组血清ACh升高，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。心肌组织中，LL－VNS组炎性因子水平明显低于假手术组及MLA＋LL－VNS组(P<0.05)，LL－VNS组和MLA＋LL－VNS组ACh水平明显高于假手术组(P<0.05)(图3)。
3组不同刺激时间血清中IL－6、TNF－α、ACh水平变化(
±s)
3组不同刺激时间血清中IL－6、TNF－α、ACh水平变化(±s)
| 组别 | 动物数 | IL－6(pg/ml) | TNF－α(pg/ml) | ACh(μg/ml) | |
|---|---|---|---|---|---|
| 假手术组 | 6 | ||||
| 基线期 | 102±9 | 17.9±1.9 | 150±4 | ||
| 3 h | 116±5a | 21.8±2.4a | 122±4a | ||
| 6 h | 119±7a | 22.1±2.0a | 123±10a | ||
| LL－VNS组 | 6 | ||||
| 基线期 | 102±4 | 18.1±1.6 | 151±12 | ||
| 3 h | 114±8a | 21.2±2.1a | 134±6a | ||
| 6 h | 101±6bc | 17.8±1.7bc | 151±13bc | ||
| MLA＋LL－VNS组 | 6 | ||||
| 基线期 | 102±6 | 18.0±2.5 | 154±10 | ||
| 3 h | 117±12a | 20.9±2.5a | 137±11a | ||
| 6 h | 102±5bc | 17.9±2.2bc | 145±5bc | ||
注：与同组基线期比较，aP<0.05；与同组3 h比较，bP<0.05；6 h后，与假手术组同时间点比较，cP<0.05
注：与假手术组比，aP<0.05；与MLA＋LL－VNS组比较，bP<0.05
与假手术组及MLA＋LL－VNS组比较，LL－VNS组心房组织中NF－κBp65蛋白明显减少(P<0.05)，STAT3蛋白显著增多(P<0.05)(图4)。
注：与假手术组比较，aP<0.05；与MLA＋LL－VNS组比较，bP<0.05
免疫荧光检测右心房、左心房、心房神经节组织中存在大量α7nAChR表达(图5)。
在房颤的发生过程中，电重构是一个极其重要的电生理基础，包括动作电位时程和有效不应期的缩短，传导速率的减慢以及有效不应期不均一性增加等，上述改变引起心房内折返波缩短，使房颤易于诱发和维持。在房颤发生及维持机制的研究中发现自主神经活性与房颤密切相关，我们前期研究发现低频率刺激迷走神经对肺静脉快速起搏引起的房颤诱发有降低作用，且抑制心房肌电重构[11]。近年来，越来越多的研究发现炎性因子如TNF－α、IL－6等与房颤的发生和维持密切相关。我们前期研究发现，消融GP后可引起心房肌神经重构及炎性因子水平升高，房颤易感性增加[12]，而低强度GP刺激降低血清炎性因子水平[13]，表明干预自主神经影响房颤的诱发与炎性因子有关。迷走神经末梢释放的ACh与α7nAChR结合，激活α7nAChR后可抑制TNF－α、IL－6等多种炎性因子的释放，从而对多种炎症反应性疾病具有保护作用，此作用机制称为胆碱能抗炎通路。
为探讨LL－VNS抑制心房肌电重构及房颤发生的机制与α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路的关系，本研究制备急性房颤模型，同时给予LL－VNS及阻断CAP后给予LL－VNS，结果显示与LL－VNS组比较，MLA＋LL－VNS组LL－VNS并不能逆转右心房起搏引起的电重构，房颤诱发率及持续时间较LL－VNS组增加，且心房肌炎性因子水平较LL－VNS组升高。
研究证实，房颤时心房肌电重构与钾、钙离子通道重构密切相关[14]，而心肌细胞及循环系统中炎症介质的浸润可引起离子通道重构。研究显示，TNF－α可引起Ca2＋通道异常[8]，选择性过表达鼠心肌组织TNF－α水平可延长动作电位和钙瞬变的时间，较正常TNF－α水平的心肌细胞钙电流增加，房颤易感性增加[7]，炎性因子可引起异向传导及心房内传导速度的下降[6]，引起心房肌电重构，而抗炎治疗可纠正炎症引起的心房内差异传导[5]。炎性因子通过调节钙稳态和连接蛋白引起细胞凋亡，促进心肌细胞纤维化，引起心房肌结构重构。本研究中，假手术组右心房快速起搏后血清及心房肌ACh水平下降，炎性因子水平升高，LL－VNS组血清及心房肌ACh水平升高，炎性因子水平下降，MLA＋LL－VNS组心房肌电重构与假手术组差异无统计学意义，表明LL－VNS可抑制心房肌炎症反应，抑制心房电重构。研究认为α7nAChR的抗炎机制主要涉及NF－κB与JAK2/STAT3两条信号转导通路，其中NF－κB是促炎因子的转录因子，STAT3是一种关键性的抗炎转录因子，我们进一步研究发现，LL－VNS组心房肌NF－κBp65蛋白水平较假手术组和MLA＋LL－VNS组明显减少，而STAT3蛋白水平增多，我们对心房肌及GP进行免疫荧光检测发现大量的α7nAChR，表明LL－VNS可激活α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路，抑制NF－κB水平，活化STAT3水平，发挥抗炎作用，进而抑制心房肌电重构。以上结果表明LL－VNS抑制房颤的作用与α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路关系密切。
综上所述，LL－VNS抑制心房肌电重构和房颤的发生与α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路有密切关系，作为一种"神经－免疫"连接的桥梁，胆碱能抗炎通路在LL－VNS抑制心房颤动的过程中发挥着重要作用，为临床房颤的治疗提供新的靶点。
