于晨起空腹留取入组者抗凝外周血10 ml，于1 000×g离心10 min收集上层血浆，－70 ℃冰箱冻存备用。下层血细胞用Ficoll淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离PBMCs，调整细胞浓度至10⁷个/ml，加入含10% DMSO的胎牛血清(FBS)，液氮冻存备用。

首先在灌洗肺段经活检孔通过硅胶管注入利多卡因行局部麻醉，将纤维支气管镜顶端紧密楔入肿瘤部位亚段支气管开口处，经硅胶管快速注入37 ℃无菌生理盐水，共灌洗4次，每次50 ml。用100 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)负压吸引回收灌洗液，保证回收效率>50%。用双层无菌纱布过滤灌洗液，记录总量，导入无菌离心管中，于4 ℃、1 000 ×g离心10 min，收集上清－70 ℃冰箱冻存备用。经离心沉淀的细胞成分用RPMI 1640培养液洗涤2次，加入含10% FBS的RPMI 1640培养液，将细胞浓度调整至10⁶个/ml。可耐受灌洗的肺癌组患者，对未发生肿瘤的肺部也进行灌洗，作为对照进行检测。

应用CD8^＋ T细胞分选试剂盒对PBMCs和BALF中的CD8^＋ T细胞进行分选。复苏冻存的PBMCs或收集新鲜分离的BALF，加入RPMI 1640培养液洗涤后于4 ℃、300×g离心10 min，用40 μl缓冲液重悬细胞，并加入10 μl生物素标记的抗体鸡尾酒，混匀后于4 ℃孵育5 min，加入30 μl缓冲液，再加入20 μl CD8^＋ T细胞磁珠鸡尾酒，混匀后于4 ℃孵育10 min。用3 ml缓冲液浸润置于MACS分离架上的分离柱，加入标记的细胞悬液，收集通过分离柱的未标记细胞(为CD8^＋ T细胞)，应用3 ml缓冲液洗涤分离柱，收集通过分离柱的细胞，于4 ℃、300 ×g离心10 min，用含10% FBS的RPMI 1640培养液培养备用。取9例肺癌组患者外周血分离的10⁵个CD8^＋ T细胞接种于96孔板中，设立4个复孔，其中2个复孔加入等量的培养液，另外2个复孔加入终浓度为5 μg/L的重组人IL－7刺激培养，12 h后收集细胞和培养上清进行后续检测。

对接受手术的肺癌组患者，取新鲜的NSCLC组织，加入适量的PBS，去除组织上的血液、脂肪组织和结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，用PBS洗涤2次后加入少量RPMI 1640培养液，将组织建成约1 mm³大小碎块。将组织碎块转入离心管中，用PBS洗涤数次，组织碎块自动下沉后移除PBS。将组织块转入培养瓶中，加入5 ml胶原酶，吹散，置37 ℃恒温摇床上消化，调节摇床速度为150次/min，每隔30 min于显微镜下观察1次。待组织块呈絮状、且透光性良好时，转入离心管中，于1 000×g离心10 min后弃上清，加入PBS洗涤数次，反复吹打后于1 000×g离心10 min，弃上清。转入培养板中，加入含10% FBS的RPMI 1640培养液培养备用。取8例肺癌组患者分离的10⁵个原代NSCLC接种于96孔板中，设立4个复孔，其中2个加入等量的培养液，另2个加入终浓度为5 μg/L的重组人IL－7刺激培养，12 h后收集细胞和培养上清进行后续检测。

建立CD8^＋ T细胞与原代NSCLC细胞直接接触培养和间接接触培养系统^[6]。收集11例患者外周血和BALF中分离的CD8^＋ T细胞，加入终浓度为5 μg/L的重组人IL－7刺激培养12 h，收集上清，进行后续检测。然后洗涤细胞2次，去除IL－7，再将CD8^＋ T细胞与自体分离的原代NSCLC细胞以1∶5的比例进行共培养。在直接接触培养系统中，将CD8^＋ T细胞与原代NSCLC细胞直接混合培养，并加入终浓度为1 μg/L的抗CD3/CD28抗体刺激培养。在间接接触培养系统中，CD8^＋ T细胞与原代NSCLC细胞分别接种于Transwell培养平板的上层小室和下层培养孔中，上层小室的底部为孔径直径为0.4 μm的滤膜，细胞不能通过滤膜，但可溶性的细胞因子可以通过滤膜。向上层小室中加入抗CD3/CD28抗体。培养48 h后收集培养上清，进行后续检测。

使用ELISA检测试剂盒检测血清、BALF或细胞培养上清中IL－7、IFN－γ和TNF－α的水平。

取10⁶个纯化的CD8^＋ T细胞，使用Trizol试剂提取总RNA。反转录反应体系：5×缓冲液2 μl，反转录酶混合物I 0.5 μl，寡聚胸腺嘧啶引物0.5 μl，随机六核苷酸引物0.5 μl，总RNA 1 μg，加入不含RNA酶的去离子水调整总体积至10 μl。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。SYBR实时定量PCR反应体系：SYBR预混Taq酶10 μl，上游引物(10 μmol/L)0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，ROX参考染料0.4 μ，cDNA 2 μl，灭菌水6.8 μl。反应条件：预变性：95 ℃ 30 s；PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。应用2^－ΔΔCT法对目的片段的相对表达量进行分析。引物序列：(1)CD127：上游5′ AAAGTTTTAATGCACGATGTAGCTT 3′，下游5′ TGTGCTGGATAAATTCACATGC 3′；(2)β－肌动蛋白：上游5′ TGGCACCAGCACAATGAA 3′，下游5′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 3′。

应用CCK－8试剂盒按说明书操作。在培养的最后4 h，向培养孔中加入20 μl CCK－8反应液，检测细胞培养液在450 nm处的吸光度，同时设立标准曲线，计算培养细胞的细胞数。

用PBS洗涤细胞，加入50 μl 2×SDS缓冲液和1 μl β－巯基乙醇，孵育5 min后用细胞刮将细胞完全刮下，转移至离心管中，95 ℃孵育10 min，12 000×g离心1 min。将待测蛋白样本加入SDS－PAGE电泳浓缩胶孔中，将蛋白分离后转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液封闭转膜后的PVDF膜，洗涤后将抗信号传导及转录激活因子5(STAT5)、抗磷酸化STAT5(pSTAT5)、抗细胞因子信号抑制物3(SOCS3)、抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)用一抗稀释液以1∶1 000进行稀释，加入PVDF膜，4 ℃孵育过夜。洗涤后将抗兔IgG－HRP用封闭缓冲液以1∶2 000进行稀释，加入PVDF膜，室温孵育1 h。洗涤后化学发光成像。利用Image J软件对蛋白条带进行半定量检测，将目标蛋白的灰度值以看家基因GAPDH的灰度值作为参照进行半定量分析。

通过检测培养上清中LDH评估原代NSCLC细胞的死亡比例。应用LDH细胞毒性检测试剂盒检测培养上清中LDH水平，以原代NSCLC细胞培养上清中的LDH水平作为"低水平LDH对照"，以Triton X－100处理的原代NSCLC细胞培养上清中的LDH水平作为"高水平LDH对照"，按以下公式计算靶细胞死亡比例：(样本LDH水平－低水平LDH对照)/(高水平LDH对照－低水平LDH对照)×100%。