探究RhoA/ROCK信号通路介导的细胞形变是否在人间充质干细胞（hMSCs）成骨分化过程中发挥调控作用。
取原代hMSCs培养至P3代加入成骨诱导液诱导14 d后，采用免疫荧光检测RhoA和ROCK-1蛋白的表达变化。另取P3代hMSCs细胞分为诱导组、空白加药组及加药组，诱导组采取单纯成骨诱导培养，空白加药组加入成骨诱导液及溶剂二甲基亚砜（DMSO）进行诱导培养，加药组加入成骨诱导液和溶于DMSO的Y-27632（RhoA/ROCK信号通路抑制剂）进行诱导培养。利用CCK-8检测细胞的增殖，荧光显微镜观察各组细胞骨架的变化，实时聚合酶链反应（RT-PCR）及碱性磷酸酶（ALP）染色检测各组细胞成骨基因ALP、骨钙素（OCN）、侏儒相关转录因子2（RUNX-2）的表达变化。两组间数据比较采用t检验。
hMSCs成骨诱导前后RhoA、ROCK-1蛋白表达呈现差异性变化，成骨诱导14 d RhoA和ROCK-1蛋白表达显著高于诱导前（22.7±2.1比14.7±0.6和24.3±1.5比20.3±0.6，t=-6.414、-4.243，均P<0.05）。与诱导组相比，加药组第1、5、9、14天干细胞增殖活性无显著变化（F=0.427、1.000、0.298、1.314，均P>0.05）。加药组细胞骨架呈明显梭形改变，细胞铺展面积变小；从第14天的3组ALP染色显示加药组的染色明显比诱导组浅。RT-PCR结果显示诱导组和空白加药组细胞随诱导时间延长其成骨表型基因表达水平呈上升趋势，加药组细胞成骨表型基因ALP、OCN、RUNX-2的表达水平随诱导时间延长逐渐下调，加药组ALP表达在第14天时显著低于其他2组（F=25.891，P=0.001）；加药组OCN表达在第11天和14天时显著低于其余2组（F=5.773、25.382，均P<0.05）；加药组RUNX-2表达在第11天和14天时显著低于其余两组（F=34.972、10.808，均P<0.05）。
RhoA/ROCK信号通路可能通过介导细胞骨架形变在hMSCs成骨分化过程中起促进作用。
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RhoA/ROCK信号通路在各种细胞功能中发挥重要作用，不仅在血管平滑肌细胞收缩、增殖、迁移和基因表达中起作用，RhoA激酶还促进了各种炎症和血栓的形成，同时降解内皮细胞一氧化氮合酶并抑制胰岛素信号传导[1]。细胞骨架由中间纤维、肌动蛋白丝和微管构成，肿瘤的转移可通过激活RhoA/ROCK信号通路直接作用于细胞骨架，使骨架发生重新排列[2]。研究表明，RhoA/ROCK信号通路参与了肌动蛋白细胞骨架的重组和肌球蛋白轻链的磷酸化[3]。人间充质干细胞（hMSCs）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，具有多项分化潜能和自我复制等特点，在临床上应用于心血管疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复等方面并取得突破。有研究发现抑制RhoA/ROCK信号通路可促进诱导效率并调节干细胞的自我更新和分化[4]。而本研究旨在探究RhoA/ROCK信号通路介导的细胞形变能否在间充质干细胞成骨分化中起调控作用。
hMSCs购自美国ScienCell公司（货号7550）。胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液（美国Gibco公司）；DMEM/F12培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Hyclone公司）；RhoA/ROCK信号通路抑制剂Y-27632（中国Abmole公司#M1817）；成骨诱导液（中国赛业公司）；二甲基亚砜（DMSO）（上海生工公司）；细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8试剂盒）（中国翔博公司）；碱性磷酸酶染色试剂盒（中国碧云天公司）；鬼笔环肽（美国Cytoskeleton公司）；二脒基苯基吲哚（DAPI）染色液（中国索莱宝公司）；兔抗鼠RhoA单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；兔抗鼠ROCK-1单克隆抗体（英国Abcam公司）；兔抗小鼠绿色荧光二抗和山羊抗兔红色荧光二抗（美国Invitrogen公司）；实时聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（日本Takara公司）；碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、侏儒相关转录因子2（RUNX-2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等基因引物（上海生工公司）；激光共聚焦显微镜、荧光显微镜（德国Leica公司）；Nanodrop2000（美国Thermo Scientific公司）；RT-PCR仪（瑞士Roche公司LightCycler480）。
将hMSCs冻存管在37 ℃水浴里迅速融解，移至15 ml离心管里1 200 r/min，离心5 min（半径20 cm），去上清，加入含10%FBS和1%青链霉素混合液的DMEM/F12培养液重悬细胞，均匀接种于培养皿内，将培养皿放入含5%CO2培养箱中培养，2~3 d换液1次，细胞单层融合80%~90%时传代。取P3代细胞用于成骨诱导液前后RhoA和ROCK-1蛋白检测实验；另取P3代细胞用于诱导组、空白加药组和加药组实验。诱导组加单纯成骨诱导液培养，空白加药组加入成骨诱导液和溶剂DMSO进行诱导培养，加药组加入成骨诱导液和溶于DMSO的Y-27632（RhoA/ROCK信号通路抑制剂）诱导培养。
取出加成骨诱导液培养前后的hMSCs，吸去培养液，用PBS洗1次，用4%多聚甲醛固定20 min后，用PBS洗3次，加入0.3%TritonX-100破膜5 min后，用PBS洗3次，每个孔加入100 μl由2%羊血清配制的封闭液，在室温下孵育1 h，后加入由封闭液按1∶200比例配制的一抗溶液100 μl，在4 ℃孵育过夜。吸除一抗，用PBS洗涤3次，每次10 min，加入同样用封闭液稀释的按1∶500比例配制的荧光二抗100 μl或200 μl，避光条件下室温孵育30 min；每个孔中加入100 μl的DAPI染液，在避光下室温孵育5 min，无需洗涤，于激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白的表达水平变化。
取P3代细胞按1×104/ml每孔200 μl接种到96孔板内放入37 ℃含5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，分别进行上述诱导组、空白加药组和加药组处理。分别于第1、5、9及14天，弃上清，每孔加入含15 μl CCK-8的培养液150 μl，继续孵育2 h，充分反应后在酶联免疫检测仪上测量波长450 nm吸收值A值，每组设4个副孔，计算其均值，绘制细胞增殖曲线。
分别取24孔板中诱导组、空白加药组和加药组细胞用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定20 min后，用PBS洗3次，加入0.3%TritonX-100破膜5 min后，用PBS洗3次，避光条件下加入鬼笔环肽染色30 min，PBS洗3次，加入DAPI室温孵育10 min，用PBS洗2次，放在荧光显微镜下观察染色情况，红色代表细胞骨架，蓝色代表细胞核。观察加药组是否能引起细胞骨架的改变。
吸除六孔板诱导组、空白加药组和加药组细胞的培养液，用PBS洗涤2次，六孔板中每孔加入1 ml的Trizol提取RNA，用Nano-drop 2000测量RNA浓度并鉴定RNA的纯度，根据测定的RNA浓度，取1 μg总RNA，根据20 μl体系，一步法反转成cDNA，将得到的cDNA稀释12.5倍，进行RT-PCR。RT-PCR扩增体系为11 μl，包括稀释的cDNA 5 μl，上下引物各0.2 μl，双蒸水0.4 μl，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）5 μl，ROX参比染料（50×）0.2 μl。样品混匀后于RT-PCR仪上反应。PCR反应引物如表1。每个模板3个副孔，以GAPDH为内参。通过原始数据计算出2-ΔΔCt的值，反映目的基因mRNA表达水平。
实时聚合酶链反应引物序列
实时聚合酶链反应引物序列
| 引物 | 引物序列（5 ′ →3 ′） | 产物长度(bp) |
|---|---|---|
| ALP（上游） | ACTGGGGCCTGAGATACCC | 185 |
| ALP（下游） | TCGTGTTGCACTGGTTAAAGC | |
| OCN（上游） | ATTGTGGCTCACCCTCCATCA | 119 |
| OCN（下游） | AGGGCTATTTGGGGGTCATC | |
| RUNX-2（上游） | TGGTTACTGTCATGGCGGGTA | 101 |
| RUNX-2（下游） | TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA | |
| GAPDH（上游） | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | 197 |
| GAPDH（下游） | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
注：ALP：碱性磷酸酶；OCN：骨钙素；RUNX-2：侏儒相关转录因子2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶
分别取24孔板中诱导组、空白加药组和加药组细胞用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min后，PBS洗3~5次，每次3~5 min，避光条件下加入ALP染色液室温孵育5~30 min，观察显色反应。颜色深浅代表hMSCs成骨分化能力强弱。
采用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据以
±s表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素的方差分析；以P<0.05为差异有统计学意义。
成骨诱导前后hMSCs中RhoA和ROCK-1蛋白表达呈差异性表达，诱导第14天RhoA和ROCK-1蛋白表达均明显高于诱导前（t=-6.414、-4.243，均P<0.05）（表2，图1）。
RhoA和ROCK-1蛋白诱导前后的表达变化（
±s）
RhoA和ROCK-1蛋白诱导前后的表达变化（±s）
| 时间 | RhoA | ROCK-1 |
|---|---|---|
| 诱导前 | 14.7±0.6 | 20.3±0.6 |
| 诱导后 | 22.7±2.1 | 24.3±1.5 |
| t值 | -6.414 | -4.243 |
| P值 | 0.016 | 0.033 |
与诱导组相比，成骨诱导第1、5、9和14天加药组干细胞增殖活性无显著变化，对其增殖活性无影响（F=0.427、1.000、0.298、1.314，均P>0.05）（表3）。
加药组对人间充质干细胞的增殖活性的影响（
±s）
加药组对人间充质干细胞的增殖活性的影响（±s）
| 组别 | 1d | 5d | 9d | 14 d |
|---|---|---|---|---|
| 诱导组 | 1.00±0.28 | 7.47±0.49 | 9.64±1.10 | 14.51±0.54 |
| 空白加药组 | 1.13±0.29 | 7.00±0.48 | 9.34±0.68 | 13.69±0.79 |
| 加药组 | 1.16±0.19 | 7.29±0.45 | 9.22±0.55 | 13.09±1.94 |
| F值 | 0.427 | 1.000 | 0.298 | 1.314 |
| P值 | 0.665 | 0.405 | 0.749 | 0.316 |
诱导组细胞形态规则，排列规整；而加药组细胞形态杂乱无章，出现了细小的伪足，呈扁平伸展样。细胞F-actin染色显示，诱导组和空白加药组细胞骨架饱满，排列整齐均匀；而加药组细胞骨架变得稀疏，呈长梭形并伴有伪足（图2）。
诱导组和空白加药组细胞随诱导时间延长其成骨表型基因表达水平呈上升趋势，而加药组则随诱导时间延长逐渐下调。加药组ALP表达在14 d时显著低于其他2组（F=25.891，P=0.001）；加药组OCN表达在第11天和14天时显著低于其余2组（F=5.773、25.382，均P<0.05）；加药组RUNX-2表达在第11天和14天时显著低于其余2组（F=34.972、10.808，均P<0.05）（表4）。
各组人间充质干细胞(hMSCs)成骨基因ALP、OCN、RUNX-2表达（
±s）
各组人间充质干细胞(hMSCs)成骨基因ALP、OCN、RUNX-2表达（±s）
| 组别 | ALP | OCN | RUNX-2 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 8d | 11 d | 14 d | 8d | 11 d | 14 d | 8d | 11 d | 14 d | |
| 诱导组 | 1.56±1.18 | 1.57±0.20 | 4.59±0.44 | 1.04±0.25 | 1.44±0.31 | 1.75±0.34 | 1.01±0.20 | 1.53±0.30 | 2.37±0.48 |
| 空白加药组 | 1.66±0.79 | 1.58±0.51 | 4.15±1.26 | 1.06±0.20 | 1.42±0.32 | 1.76±0.28 | 1.03±0.25 | 1.61±0.48 | 2.29±0.92 |
| 加药组 | 1.62±0.76 | 1.48±0.17 | 0.46±0.10 | 0.98±0.05 | 0.66±0.33 | 0.32±0.23 | 0.83±0.28 | 0.45±0.08 | 0.41±0.08 |
| F值 | 0.009 | 0.074 | 25.891 | 0.148 | 5.773 | 25.382 | 0.630 | 34.972 | 10.808 |
| P值 | 0.991 | 0.930 | 0.001 | 0.865 | 0.040 | 0.001 | 0.564 | 0.000 | 0.010 |
注：ALP：碱性磷酸酶；OCN：骨钙素；RUNX-2：侏儒相关转录因子2
加药组ALP染色明显比其余两组浅，说明加药组中，hMSCs成骨分化能力最弱（图3）。
骨稳态取决于破骨细胞的溶骨活性与成骨细胞的成骨作用之间的相对平衡。成骨细胞具有维持骨骼结构、调控骨矿化和破骨细胞的功能，成骨细胞分化受到很多信号通路及多种细胞因子的影响[5]。RhoA蛋白属于小G蛋白超家族的亚家族成员，具有GTP酶活性，在细胞骨架成骨调控和细胞有丝分裂中起重要作用[6]。ROCK蛋白是目前研究相对较清晰的效应分子，属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶成员，分为ROCK-1和ROCK-2两个亚型，主要通过调节肌动蛋白在调控细胞的运动、形态、极性、分裂和基因表达等方面发挥生理功能[7]。RhoA/ROCK信号通路是细胞在生长过程中一条重要的通路，同时还参与多种疾病的发生，被激活时，其可在活性GTP结合状态和无活性GDP结合状态之间循环，调节肌动蛋白细胞骨架；还可调控细胞周期，基因转录及细胞迁移和生存，有助于组织修复和再生，并推动肿瘤、智力障碍、动脉粥样硬化和关节炎的疾病进展[8]。
间充质干细胞（MSCs）具有更新的能力和在培养物中分化成数种细胞类型的潜力。许多研究表明，阻断RhoA/ROCK信号通路可促进MSCs向神经细胞分化，控制RhoA激酶活性可提高基于干细胞的神经退行性疾病治疗的效率[9]。Li等[10]研究发现，可通过改变RhoA/ROCK信号通路促进牛角膜内皮细胞的增殖，并显著增强牛角膜内皮细胞的黏附和迁移。用RhoA/ROCK信号通路抑制剂处理的牛角膜内皮细胞表现出更强烈的生长和更多的铺展形态。Wang等[11]研究发现，抑制RhoA/ROCK信号通路可促进人牙周膜干细胞增殖及成骨和成脂分化，使牙周组织再生，从而促进牙周组织再生。刘筱等[12]发现，阻断RhoA/ROCK信号通路可促进大鼠骨髓MSCs的增殖和分裂及DNA的合成。也有研究表明，RhoA/ROCK信号通路参与细胞骨架的形成，可通过改变细胞之间不同的接触面积来促进成骨分化[13]。Xu等[14]研究也发现，当给予细胞适当的应力刺激时，可激活RhoA/ROCK信号，改变细胞骨架可促进细胞成骨分化。
ALP作为细胞早期成骨分化重要的指标之一，是骨形成过程中必需的酶，ALP的mRNA水平升高完全归因于基因转录的变化，对信息稳定性无影响，而且ALP还可促进钙在胶原上沉积，导致基质的钙化[15]。OCN是由成骨细胞合成并分泌的一种钙结合蛋白，比较稳定，在维持人体内钙磷稳态中起重要作用[16]。转录因子RUNX-2是细胞成骨分化过程中作为必需的调节靶标，RUNX-2的激活会促进成骨基因转录[17]。RhoA/ROCK信号通路参与调节这些成骨基因和肌动蛋白在成骨细胞中的表达[18]。
本实验提示RhoA/ROCK信号通路在MSCs成骨分化过程中被激活了，这与徐亮等[19]研究的结果一致。RhoA/ROCK信号通路激活可调控软骨细胞的退变[20]。Appleton等[21]发现RhoA和ROCK-1表达上调后RhoA/ROCK信号被激活，软骨细胞骨架发生重组，大量应力纤维生成，基质加速分解，软骨基因表达明显下降。本研究发现抑制RhoA/ROCK信号通路后，细胞骨架也发生了明显的重组改变，骨架呈长梭形，并伴有细小的伪足，成骨基因表达水平显著下调。所以我们认为RhoA/ROCK信号通路可能通过改变细胞骨架形变从而在hMSCs成骨分化过程中起调控作用。本研究只是对RhoA/ROCK信号通路在MSCs成骨分化过程中的调控作用进行了初步分析，RhoA/ROCK信号通路在细胞成骨分化作用中的机制尚不完全清楚，其对细胞形变和成骨分化调控的机制有待进一步研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
