探讨影响幕上间变性胶质瘤患者预后的相关因素，拟制定一份预后评分量表，为临床治疗提供理论参考。
收集2009年1月至2018年1月河南省人民医院神经外科手术治疗的198例原发间变性胶质瘤患者的临床资料。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析使用Cox比例风险模型，筛选预后相关因素，并利用预后因素制定一份预后评分量表。
单因素分析结果显示年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、术前KPS、切除程度、放疗、化疗、病理含少突成分、1p/19q、IDH、MGMT与患者预后显著相关（P<0.05）；多因素分析结果显示年龄≥45岁、肿瘤直径≥6 cm、术前KPS<70、未放疗、1p/19q未缺失、MGMT启动子非甲基化均为独立预后危险因子（P<0.05）。每项独立预后危险因子给予评价1分，患者评分则为0~6分；依据评分将患者分组，其中<2分者为低危组、2分者为中危组、3分者为高危组，≥4分者为极高危组，不同组别患者生存期差异有统计学意义（P<0.000 1）。
患者评分越高，预后越差；该预后评分量表可以为间变性胶质瘤患者预后判断提供理论依据，有助于开展个体化临床治疗。
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胶质瘤是颅内最常见的原发恶性肿瘤，约占所有颅内肿瘤的46.1%[1]。以往胶质瘤的病理学诊断主要是依靠细胞形态学表现，其主观性强，临床诊断差异大，尤其是混合型胶质瘤诊断一致率极低，这一直是困扰广大病理医师及神经外科医师的难题[2]。2016年，国际神经病理协会发布了新型中枢神经系统肿瘤分类标准（即2016版）[3]。新分类标准纳入了1p/19q联合缺失、IDH突变等分子标志物用以协助病理诊断，开启了分子病理时代[2,4,5,6]。国内外学者将世界卫生组织（WHO）Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤称为高级别胶质瘤，目前针对高级别胶质瘤的研究主要集中在胶质母细胞瘤（GBM，WHO Ⅳ级），而关于间变性胶质瘤（WHO Ⅲ级）的研究较少[7,8]。故本研究对2009年1月至2018年1月于河南省人民医院神经外科治疗的198例间变性胶质瘤患者进行病理学重新分类和临床资料回顾性分析，并拟建立一份预后评估量表，协助医师及家属判断患者预后。
198例为手术治疗、具有完整病历记录及可靠随访资料的原发间变性胶质瘤患者。入组标准：（1）于河南省人民医院神经外科接受手术治疗；（2）年龄≥18岁；（3）术后病理学证实为间变性胶质瘤（WHO Ⅲ级）；（4）无严重心、肺、肝、肾疾病。排除标准：（1）无分子标志物检测结果者；（2）随访资料不全者；（3）同时合并其他系统肿瘤。198例患者具体临床资料见表1。
198例WHO Ⅲ级胶质瘤患者的一般临床资料
198例WHO Ⅲ级胶质瘤患者的一般临床资料
| 项目 | 数量 | |
|---|---|---|
年龄（岁， ± s） | 43±13 | |
| 男性患者［例 (%)］ | 130(65.7) | |
肿瘤直径(mm， ± s） | 44±20 | |
KPS（分， ± s） | 81±13 | |
| 症状持续时间［月，中位数（范围）］ | 2.0(0.1~18) | |
| 肿瘤部位［例(%)］ | ||
| 额叶 | 66(33.3) | |
| 颞叶 | 54(27.3) | |
| 顶叶 | 31(15.7) | |
| 枕叶 | 27(13.6) | |
| 其他 | 20(10.1) | |
| 术前癫痫［例(%)］ | ||
| 是 | 41(20.7) | |
| 切除程度［例(%)］ | ||
| 全切 | 135(68.2) | |
| 次全切 | 41(20.7) | |
| 部分切除 | 22(11.1) | |
| 化疗［例(%)］ | ||
| 是 | 163(82.3) | |
| 放疗［例(%)］ | ||
| 是 | 150(75.8) | |
| 染色体1p/19q［例(%)］ | ||
| 联合缺失 | 56(28.3) | |
| IDH［例(%)］ | ||
| 突变型 | 101(51.0) | |
| MGMT启动子［例(%)］ | ||
| 甲基化 | 104(52.5) | |
| 病理学类型［例(%)］ | ||
| AO | 33(16.7) | |
| AOA | 107(54.0) | |
| AA | 58(29.3) | |
注：KPS：Karnofsky performance score评分；AO：间变少突胶质细胞瘤；AOA：间变少突星形细胞瘤；AA：间变星形细胞瘤（下表同）
患者随访资料均以门诊复查、电话问询或查阅病历形式获得，每3个月随访1次，病情恶化者每月随访1次，死亡作为随访终点。总体生存期（OS）定义为手术当日至患者死亡的时间段。本组患者中位随访时间43.0（1~93）个月。
新鲜肿瘤组织甲醛固定，制作石蜡切片并行HE染色，在光镜下进行形态学观察，选取无出血、无坏死的肿瘤区域进行荧光原位杂交。选取1p/19q荧光探针试剂盒（美国，Vysis），1p36/1q25包含红色靶位点探针1p36和绿色参照探针1q25，用于检测1p36；19q13/19p13包含红色靶位点探针19q13和绿色参照探针19p13，用于检测19q13。实验步骤按说明书完成。DAPI复染肿瘤细胞核，荧光显微镜观察。选取核大小一致、边界完整、孤立无重叠并且DAPI染色均一的细胞。随机计数100个癌细胞核中双色信号，红色信号=绿色信号细胞评判为非缺失细胞，红色信号<绿色信号细胞则评判为缺失细胞。缺失细胞比率>30%判定为缺失阳性。本组样本中1p/19q联合缺失56（28.3%）例，1p/19q未缺失142（71.7%）例。
切取石蜡标本10 μm厚切片10片左右，置于无菌EP管中，二甲苯溶，55 ℃旋涡振荡10 min，12 000 r/min离心，弃上清，重复3次；100%乙醇重悬，静置5 min，12 000 r/min离心2 min，70%乙醇重复上述步骤1次，弃上清，酚氯仿法抽提；-20 ℃保存。IDH序列设计引物：IDH1 F：5′ACCAAATGGCACCATACG 3′；R：5′TTCATA CCTTGCTTAATGGGG 3′。IDH2 F：5′GCTGCAGT GGGACCACTATT 3′；R：5′ TGTGGCCTTGTACTG CAGAG 3′。PCR体系：25 μl应体系：10×PCR缓冲液2.5 μl（含MgCl2），0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各60 pmol/L，Taq酶2.5 U，DNA模板约100 ng，剩余体积用纯水补充。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，37个循环，72 ℃再延伸5 min。取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。再对确定的样本进行DNA测序，与野生型IDH进行序列比对，判断突变点。本组样本中IDH突变101（51.0%）例，IDH未突变97（49.0%）例。
参照德国Qiagen公司TIANamp Genomic DNAKit产品说明书提取DNA。DNA抽提后用琼脂凝胶电泳和紫外分光光度仪检测纯度及含量。引物序列如下：非甲基化引物，F：5′ TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT 3′；R：5′ AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA 3′。甲基化引物，F：5′ TTTCGACGTTCGTAGG TTTTCGC 3′；R：5′ GCACTCTTCCGAAAACGAA ACG 3′。DNA扩增选用热启动Taq酶（Qiagen公司），PCR反应条件为：95 ℃变性10 min，95 ℃变性30 s，59 ℃变性30 s，72 ℃变性30 s，40个循环，72 ℃延伸10 min。以正常人外周血淋巴细胞（PBL）DNA作为甲基化阴性对照，以甲基化酶Sss Ⅰ（NEB公司）处理的PBL DNA作为甲基化阳性对照，蒸馏水代替模板作为空白对照。PCR产物用2%琼脂凝胶电泳分离，EB染色，紫外光凝胶成像系统观察结果。本组样本中MGMT启动子甲基化104（52.5%）例，MGMT启动子非甲基化94（47.5%）例。
采用SPSS 19.0软件统计分析数据，计量资料符合正态分布者以
±s表示，不符合正态分布者采用中位数（范围）表示，计数资料以率表示。生存分析中单因素分析采用Kaplan-Meier法，使用Log-rank检验；对单因素分析中有统计学意义的因素纳入Cox比例风险模型，使用逐步回归分析（L-R）进行判断；所有检验均为双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
依据2007版中枢神经系统肿瘤分类标准，其中间变少突胶质细胞瘤（AO）33（16.7%）例，间变少突星形细胞瘤（AOA）107（54.0%）例，间变星形细胞瘤（AA）58（29.3%）例。依据 2016版中枢神经系统肿瘤分类标准，其中56例样本重新诊断为AO 1p/19q缺失+IDH突变型、45例诊断为AA IDH突变型、97例诊断为AA IDH野生型。
单因素分析结果显示年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、术前KPS、切除程度、放疗、化疗、病理含少突成分、1p/19q、IDH、MGMT与患者预后显著相关（P<0.05）。将此11项预后因子纳入Cox多因素分析，结果显示，年龄≥45岁、肿瘤直径≥6 cm、术前KPS<70分、未放疗、1p/19q未缺失、MGMT启动子非甲基化均为独立预后危险因子（P<0.05），表2。Log-rank检验结果显示，2007版和2016版中枢神经系统肿瘤分类标准均可将患者分成3个具有不同预后的病理学亚组（P<0.001），图1。
198例世界卫生组织Ⅲ胶质瘤患者单因素及多因素分析结果
198例世界卫生组织Ⅲ胶质瘤患者单因素及多因素分析结果
| 临床因素 | 单因素分析 | Cox多因素分析 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 中位生存期（月） | P值 | HR | 95 % CI | P值 | ||
| 术前因素 | ||||||
| 年龄（≥45/<45岁） | 25.0/33.0 | 0.027 | 1.521 | 1.01~2.273 | 0.040 | |
| 性别（男/女） | 29.0/31.0 | 0.387 | ||||
| 症状持续时间（≥3/<3个月） | 31.0/29.0 | 0.831 | ||||
| 术前癫痫（是/否） | 44.0/29.0 | 0.116 | ||||
| 肿瘤部位（额颞/非额颞） | 38.5/18.5 | <0.001 | ||||
| 肿瘤直径(≥6/<6 cm) | 13.0/34.0 | <0.001 | 4.291 | 2.696~6.828 | <0.001 | |
| 术前KPS（≥70/<70分） | 38.0/12.0 | <0.001 | 0.308 | 0.202~0.471 | <0.001 | |
| 术中因素 | ||||||
| 切除程度（全切/非全切） | 38.0/19.5 | 0.001 | ||||
| 术后因素 | ||||||
| 放疗（是/否） | 33.0/20.0 | 0.001 | 0.451 | 0.283~0.717 | 0.001 | |
| 化疗（是/否） | 31.0/20.0 | 0.034 | ||||
| 病理含少突成分（是/否） | 38.0/20.0 | <0.001 | ||||
| 1p/19q（联合缺失/未缺失） | 71.0/23.5 | <0.001 | 0.457 | 0.283~0.737 | <0.001 | |
| IDH（突变型/野生型） | 39.0/19.6 | <0.001 | ||||
| MGMT（甲基化/非甲基化） | 38.0/24.0 | 0.002 | 1.976 | 1.319~2.960 | 0.001 | |
注：HR：风险比；CI：可信区间
根据上述Cox多因素分析结果，将6个独立预后危险因子分别给予评价1分；并据此将198例患者进行量化评分，最低0分，最高6分；再进一步将患者分组，其中<2分者为低危组（55例）、2分者为中危组（61例）、3分者为高危组（47例），≥4分者为极高危组（35例）。Kaplan-Meier法分析结果显示，低、中、高及极高危组患者的生存期差异有统计学意义（P<0.001），其中低危组中位OS 48.0个月，中危组30.0个月，高危组23.5个月，极高危组15.0个月，图2。
本研究应用单因素和多因素分析法，成功筛选出6个影响患者生存期的独立预后危险因子，分别是年龄≥45、肿瘤直径≥6 cm、术前KPS<70分、未放疗、1p/19q未缺失、MGMT启动子非甲基化。基于此6项预后危险因子，制定出一份适合我国间变性胶质瘤患者的预后评分量表，依据此量表我们将患者分为低、中、高、极高危组，不同组间患者生存期差异有统计学意义。
如今已步入精准医疗时代，综合患者一般情况、肿瘤性质、分子标志物表型可以为患者的诊断、治疗、预后评估等提供个体化参考信息[9]。关于胶质瘤患者预后分级评估系统，早在2004年国外学者就进行过研究[10]。Lamborn等[10]利用年龄<40岁、肿瘤部位、肿瘤切除程度、KPS评分>70分及化疗与否这些独立预后因素制定了一份胶质瘤预后评分量表，为临床医师开展个体化治疗提供一定参考依据[10]。一项来自美国加州大学旧金山分校神经外科中心的研究，选取年龄>50岁、KPS评分≤ 80分、肿瘤部位、肿瘤直径>4 cm 4项预后因子，成功定出一份针对大脑半球低级别胶质瘤患者的术前预后评估模型[11]。约翰霍普金斯医院的Chaichana教授等[12]则依据年龄>60岁、KPS评分≤80分、运动功能障碍、语言功能障碍及肿瘤是否位于脑室旁对GBM患者进行预后分级。国内刘威等[13]采用Logistic回归分析筛选出年龄、术前KPS评分、肿瘤坏死、手术切除程度4项预后因子，并据此4项因子建立GBM患者预后分级系统。北京天坛医院蒋海辉等[7]则依据年龄≥50岁、术前无癫痫及肿瘤位于非额颞部位3项预后危险因子将GBM分为低、中、高危组，并进一步发现高危组患者全切率低，术后并发症多，不适合采取激进的手术方式。本研究综合了患者术前、术中、术后相关预后因素，应用生存分析法筛选影响患者预后的独立危险因子，并勾勒出一份国内幕上间变性胶质瘤患者的预后评分量表。在此预后评分量表中极高危组患者的中位OS为15.0个月，这与国外报道的GBM患者预后接近[14]。针对这部分极高风险WHO Ⅲ级胶质瘤患者，临床治疗上，我们可以参照GBM的治疗方案，积极而又合理的Stupp方案可以使这类患者获益最大。
此外，本研究初步分析了2007版和2016版中枢神经系统肿瘤分类标准在判断间变性胶质瘤患者预后中的意义。结果显示两个版本的分类标准均可以将患者分成3个具有不同预后的病理亚组。但是相较于2007版，新分类标准中删除了诊断最为困难的混合型胶质瘤，取而代之的是依靠客观指标1p/19q、IDH来协助诊断，这降低了临床病理学诊断难度，大大提高了病理学诊断的正确率及一致性[15,16]。
综上所述，年龄≥45岁、肿瘤直径≥6 cm、术前KPS<70分、未放疗、1p/19q未缺失及MGMT启动子非甲基化是影响幕上间变性胶质瘤患者预后的重要因素。综合利用该6项预后因子制定出的预后评分量表，可协助临床医师及家属判断患者预后，在日后指导我国脑胶质瘤患者精准治疗有着积极意义。
本研究得到了首都医科大学附属北京天坛医院蒋海辉的大力协助
所有作者均声明不存在利益冲突
