探讨Toll样受体7（Toll-like receptor 7, TLR7）对乳腺癌患者CD8+T细胞功能的影响。
入组2017年12月—2018年3月在新乡医学院第一附属医院就诊的33例乳腺癌患者、23例乳腺良性肿块患者和20例健康对照。分离外周血单个核细胞（PBMC），分选CD8+T细胞，应用流式细胞术和实时定量PCR法检测CD8+T细胞中TLR7蛋白表达和mRNA相对表达量。使用TLR7激动剂CL097刺激CD8+T细胞，检测穿孔素、粒酶B和FasL mRNA相对表达量的变化。建立CD8+T细胞和乳腺癌细胞系MCF-7的直接/间接接触共培养细胞，观察TLR7激动剂对CD8+T细胞杀伤和非杀伤功能的影响。
TLR7蛋白在乳腺癌患者CD8+T细胞的平均荧光强度为124.0±15.3，显著低于乳腺良性肿块患者（255.5±54.9）和健康对照（261.9±68.7）（P<0.000 1）。TLR7 mRNA在乳腺癌患者CD8+T细胞中的相对表达量（1.97±1.18）亦显著低于乳腺良性肿块患者（4.84±1.01）和健康对照（4.75±1.40）（P<0.000 1）。TLR7激动剂CL097刺激可显著增加CD8+T细胞中穿孔素和粒酶B mRNA的相对表达量（P<0.01），但FasL mRNA的相对表达量在经CL097刺激和无CL097刺激的CD8+T细胞中的差异无统计学意义（P>0.05）。TLR7激动剂CL097刺激还可显著提升乳腺癌患者CD8+T细胞对MCF-7细胞的杀伤和非杀伤功能，表现为直接和间接接触共培养系统中靶细胞死亡比例的升高和干扰素-γ分泌的增加。
TLR7激动剂可增强乳腺癌患者CD8+T细胞的功能。
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Toll样受体（TLR）是固有免疫应答中重要的分子，可以通过识别病原相关的分子模式活化一系列信号通路，发挥免疫防御功能[1]。TLR7的识别谱广，生物学作用广泛，可调控获得性免疫应答和炎症反应，在多种疾病中发挥作用[2]。研究发现，TLR7激动剂在乳腺癌动物模型中可发挥抗肿瘤活性[3]，但机制尚未完全阐明。由于TLR7激动剂可调节CD8+T细胞功能[4]，因此，本研究探讨了乳腺癌患者CD8+T细胞中TLR7的表达情况，并观察TLR7激动剂对乳腺癌患者CD8+T细胞功能的影响。
收集2017年12月至2018年3月新乡医学院第一附属医院就诊的乳腺癌患者33例（其中浸润性导管癌Ⅰ~Ⅱ级12例、浸润性导管癌Ⅲ级15例、大汗腺性导管内癌3例、小叶原位癌3例），均为女性，年龄（43.7±11.2）岁（29~66岁），入组标准：（1）诊断均符合中国临床肿瘤学会乳腺癌诊疗指南2017.V01的标准，经病理学检查确诊为乳腺癌；（2）年龄>18岁；（3）获得知情同意；（4）入组前均未进行放疗、化疗、免疫及靶向治疗。排除标准：（1）合并活动性肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒感染者；（2）合并严重心脑疾病、肺部感染或败血症者；（3）长期接受免疫抑制剂治疗者。同时，入组同时期在我科治疗的女性乳腺良性肿块患者23例，年龄（39.2±12.7）岁（21~54岁），以及在我院进行健康体检的女性健康志愿者20例，年龄（41.5±9.8）岁（27~55岁）。本研究方案通过新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准（批准号：XMUEC2017060），入组者或家属均签署知情同意书。
淋巴细胞分离液（美国Sigma公司，生产批号：RNBG7296）；CD8+T细胞分选试剂盒（德国美天旎公司，生产批号：5170116461）；TLR7激动剂CL097（美国Invivogen公司，批号：7195595）；抗CD3-FITC（批号：7200698）、抗CD8-APC（批号：8047532）、抗TLR7-PE（批号：8037703）（美国BD公司）；TriPure RNA提取试剂（瑞士罗氏公司，批号：94012120）；反转录试剂盒（批号：20032322）和FastStart DNA Master SYBR Green I实时定量PCR试剂盒（批号：35732800）（瑞士罗氏公司）；人7种促炎因子检测试剂盒（美国Meso Scale Discovery公司，批号：1609261）；乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（深圳迈瑞生物医疗公司，批号：142715003）。FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；LightCycler实时定量PCR仪（瑞士罗氏公司）；Luminex 200多因子分析仪（美国Meso Scale Discovery公司）。
晨起抽取入组患者、志愿者外周血20 ml，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。使用淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离PBMCs，调整细胞浓度至107个/ml，冻存备用。
复苏冻存的PBMCs，加入RPMI 1640培养液洗涤后于4 ℃、300×g离心10 min，加入40 μl缓冲液重悬细胞，同时加入10 μl生物素标记的抗体鸡尾酒，于4 ℃孵育5 min，加入30 μl缓冲液，同时加入20 μl CD8+T细胞磁珠鸡尾酒，于4 ℃孵育10 min。将上述细胞混悬液加入应用3 ml缓冲液预处理的分离柱中，通过MACS磁力分离架，收集通过分离柱的细胞即为CD8+T淋巴细胞。选择10例健康对照和21例乳腺癌患者，取106个纯化的CD8+T细胞，加入终浓度为5 μg/ml的TLR7激动剂CL097刺激培养12 h后，收集细胞进行后续检测。
人乳腺癌细胞MCF-7由本室保存，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。取12例HLA-A*0201阳性乳腺癌患者的CD8+T细胞，加入终浓度为5 μg/ml的TLR7激动剂CL097刺激培养12 h，洗涤细胞，取106个刺激后的CD8+T细胞与5×106个MCF-7细胞建立共培养系统[5]。直接接触共培养系统：将CD8+T细胞与MCF-7细胞直接混合培养，并加入终浓度为1 ng/ml的抗CD3/抗CD28抗体刺激培养。间接接触共培养系统：将CD8+T细胞与MCF-7细胞分别接种于Transwell培养平板的上层小室和下层培养孔中，上层小室底部为孔径为0.4 μm的滤膜，仅可溶性细胞因子可以通过，细胞不能通过滤膜，上层小室中加入抗CD3/抗CD28抗体刺激培养。共培养48 h后收集上清进行后续检测。
取PBMC，洗涤2次后加入抗CD3-FITC、CD8-APC各5 μl进行表面染色后加入抗TLR7-PE进行细胞内染色，使用FlowJo Version8.4.2软件分析。
取106个CD8+T细胞，使用TriPure RNA提取试剂提取总RNA。反转录体系：缓冲液4 μl，随机六核苷酸引物2 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，dNTP 2 μl，反转录酶0.5 μl，总RNA 1 μg，DEPC水调整总体积至20 μl。反应条件：50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。实时定量PCR体系：FastStart缓冲液5 μl，PCR核苷酸混合物1 μl，上游引物（10 μmol/L）2 μl，下游引物（10 μmol/L）2 μl，cDNA 5 μl，灭菌水调整总体积至50 μl。反应条件：预变性：94 ℃ 5 min；PCR反应94 ℃ 10 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。应用2-ΔΔCT法对目的片段的相对表达量进行分析。引物序列：TLR7：上游5′ CAA TTG CTT CCG TGT CAT CCA G 3′，下游5′ TCC CTA TGG AAC CCA GAA GCA G 3′；穿孔素：上游5′ CGC CTA CCT CAG GCT TAT CTC 3′，下游5′ CCT CGA CAG TCA GGC AGT C 3′；粒酶B：上游5′ TGG GGG ACC CAG AGA TTA AAA 3′，下游5′ TTT CGT CCA TAG GAG ACA ATG C 3′；FasL：上游5′ TCA ATG AAA CTG GGC TGT ACTTT 3′，下游5′ AGA GTT CCT CAT GTA GAC CTT GT 3′；GAPDH：上游5′ CGG GAA ACT GTG GCG TGA T 3′，下游5′ CAT GGC AAC TGA TGA GGA GGG 3′。
检测培养上清中LDH水平，以MCF-7细胞培养上清中的LDH水平作为"低水平LDH对照"，以Triton X-100处理的MCF-7细胞培养上清中的LDH水平作为"高水平LDH对照"。按下述公式计算靶细胞的死亡比例：（样本LDH水平—低水平LDH对照）/（高水平LDH对照—低水平LDH对照）×100%。
使用人7种促炎因子检测试剂盒对培养上清中的干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-1β、IL-10、IL-12p70、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平进行检测。在Luminex 200TM仪上使用xPONENT软件检测平均荧光强度，利用5-参数回顾法计算细胞因子浓度。
使用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料采用
±s表示，采用方差分析和SNK-q检验进行多组间数据比较，采用配对t检验进行刺激前后数据比较。P<0.05为差异有统计学意义。
TLR7在CD8+T细胞中检测的典型流式细胞图如图1所示。TLR7在乳腺癌患者CD8+T细胞的平均荧光强度（MFI）显著低于健康对照和乳腺良性肿块患者（表1），而TLR7 MFI在健康对照和乳腺良性肿块患者CD8+T细胞中的差异无统计学意义（P=0.739，表1）。TLR7 mRNA在乳腺癌患者CD8+T细胞中的相对表达量亦显著低于健康对照和乳腺良性肿块患者（表1），而TLR7 mRNA的相对表达量在健康对照和乳腺良性肿块患者CD8+T细胞中的差异无统计学意义（P=0.817，表1）。
健康对照、乳腺良性肿块患者、乳腺癌患者TLR7 MFI和mRNA相对表达量的比较
健康对照、乳腺良性肿块患者、乳腺癌患者TLR7 MFI和mRNA相对表达量的比较
| 项目 | 健康对照 | 乳腺良性肿块患者 | 乳腺癌患者 |
|---|---|---|---|
| 例数 | 20 | 23 | 33 |
| TLR7 MFI | 261.9±68.7 | 255.5±54.9 | 124.0±15.3a |
| TLR7 mRNA | 4.75±1.40 | 4.84±1.01 | 1.97±1.18a |
注：TLR7：Toll样受体7；MFI：平均荧光强度。与健康对照和乳腺良性肿块患者相比，aP<0.000 1
TLR7激动剂CL097刺激可显著增加健康对照和乳腺癌患者CD8+T细胞中TLR7 mRNA的相对表达量（表2）。乳腺癌患者CD8+T细胞中穿孔素、粒酶B和FasL mRNA的相对表达量显著低于健康对照（P<0.05，表2），而CL097刺激后穿孔素和粒酶B mRNA的相对表达量较未刺激组显著升高（表2），但FasL mRNA的相对表达量在CL097刺激前后的差异无统计学意义（表2）。
TLR7激动剂刺激对CD8+T细胞穿孔素、粒酶B和FasL mRNA表达的影响
TLR7激动剂刺激对CD8+T细胞穿孔素、粒酶B和FasL mRNA表达的影响
| 项目 | 健康对照(n=10) | 乳腺癌患者(n=21) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 无CL097刺激 | 经CL097刺激 | P值 | 无CL097刺激 | 经CL097刺激 | P值 | |
| TLR7 mRNA | 5.20±1.69 | 14.56±4.74 | <0.000 1 | 1.90±1.19 | 4.68±1.23 | <0.000 1 |
| 穿孔素mRNA | 2.75±0.77 | 7.37±1.12 | <0.000 1 | 1.01±0.46 | 4.41±1.29 | <0.000 1 |
| 粒酶mRNA | 1.87±0.84 | 3.67±1.41 | 0.002 8 | 1.28±0.63 | 5.19±1.29 | <0.000 1 |
| FasL mRNA | 2.28±0.74 | 2.15±0.77 | 0.700 | 1.07±0.12 | 1.01±0.14 | 0.156 |
注：TLR7：Toll样受体7
经TLR7激动剂CL097刺激后，CD8+T细胞的细胞杀伤功能显著高于无CL097刺激的CD8+T细胞，主要表现为在直接接触和间接接触共培养系统中，MCF-7细胞死亡率在经CL097刺激的CD8+T细胞中显著高于无CL097刺激的CD8+T细胞（表3）。在直接接触共培养系统中，经CL097刺激后，CD8+T细胞分泌IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的水平显著高于无CL097刺激的CD8+T细胞；但在间接接触共培养系统中，经CL097刺激的CD8+T细胞仅IFN-γ的分泌水平明显升高，其他促炎细胞因子在经CL097刺激和无CL097刺激之间的分泌水平的差异无统计学意义（表3）。
TLR7激动剂刺激对乳腺癌患者CD8+T细胞功能的影响
TLR7激动剂刺激对乳腺癌患者CD8+T细胞功能的影响
| 检测项目 | 直接接触共培养系统(n=12) | 间接接触共培养系统(n=12) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 无CL097刺激 | 经CL097刺激 | P值 | 无CL097刺激 | 经CL097刺激 | P值 | |
| 靶细胞死亡(%) | 21.28±7.91 | 29.88±6.24 | 0.001 3 | 8.34±2.26 | 15.71±4.84 | <0.000 1 |
| IFNγ (ng/L) | 37.79±8.15 | 71.45±26.40 | <0.000 1 | 14.29±6.39 | 23.68±7.48 | 0.000 5 |
| IL1β (ng/L) | 8.85±2.17 | 13.57±2.39 | 0.036 | 5.43±1.64 | 6.12±0.95 | 0.172 |
| IL10 (ng/L) | 9.24±2.98 | 10.52±1.21 | 0.673 | 9.81±0.94 | 12.09±3.82 | 0.121 |
| IL12p70 (ng/L) | 20.06±4.72 | 21.42±6.77 | 0.838 | 4.93±1.06 | 6.21±2.62 | 0.227 |
| IL6 (ng/L) | 42.83±6.38 | 55.45±7.48 | 0.004 7 | 20.15±6.47 | 24.74±7.01 | 0.098 |
| IL8 (ng/L) | 8.62±0.95 | 14.21±2.01 | <0.000 1 | 7.33±2.04 | 8.08±3.02 | 0.315 |
| TNFα (ng/L) | 264.5±64.30 | 303.5±52.34 | 0.006 4 | 129.9±38.6 | 140.7±27.21 | 0.083 |
注：TLR7：Toll样受体7；IFN：干扰素；IL：白细胞介素；TNF：肿瘤坏死因子
肿瘤患者的免疫应答受抑制，造成免疫分子表达下降，而肿瘤细胞本身也能诱导TLR7表达下调。本研究结果与文献报道一致，TLR7在乳腺癌CD8+T细胞中的表达水平显著降低。研究发现，多种新型的TLR7激动剂可通过降低肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、调控肿瘤微环境、增强放疗/化疗敏感性等多种机制发挥抗乳腺癌的作用[4, 6,7]，而TLR7也可通过活化CD4+T细胞和树突状细胞，在体内和体外发挥抑制乳腺癌细胞生长的活性[8]。但有关TLR7调控乳腺癌患者CD8+T细胞功能的研究尚未见相关报道。
在正常情况下，CD8+T细胞主要通过穿孔素/粒酶、Fas/FasL这两条独立信号转导通路发挥抗原识别介导的直接细胞杀伤功能，也可通过分泌细胞因子通过非细胞杀伤功能诱导靶细胞死亡[9,10]。直接接触和间接接触培养系统可区分CD8+T细胞的这两种功能，直接接触共培养系统中，CD8+T细胞可同时发挥细胞杀伤和非细胞杀伤双重功能，间接接触共培养细胞中，CD8+T细胞仅发挥非细胞杀伤功能[5]。恶性肿瘤患者存在CD8+T细胞功能不全，可造成肿瘤细胞免疫逃逸，导致肿瘤细胞异常增殖和转移。本研究发现，乳腺癌患者CD8+T细胞中穿孔素、粒酶B和FasL mRNA相对表达量显著均低于健康志愿者，提示乳腺癌患者的CD8+T细胞存在功能不全，而TLR7激动剂刺激可提高CD8+T细胞中穿孔素和粒酶B mRNA相对表达量，但对FasL mRNA无显著影响，说明TLR7激动剂主要通过影响穿孔素/粒酶通路调节CD8+T细胞功能。在直接接触共培养系统中，TLR7激动剂刺激CD8+T细胞可诱导靶细胞的死亡比例升高和多种促炎细胞因子分泌的增加，提示TLR7激动剂可增强CD8+T细胞的杀伤和非杀伤双重功能。在间接接触共培养系统中，虽然TLR7激动剂也可增加靶细胞的死亡，但仅IFN-γ的分泌增加，提示IFN-γ可能是CD8+T细胞发挥抗肿瘤效应的主要细胞因子。
总之，TLR7的表达降低可能与乳腺癌患者CD8+T细胞功能不全有关。TLR7激动剂可能增强乳腺癌患者CD8+T细胞的抗肿瘤功能。TLR7激动剂可能作为提高肿瘤患者机体细胞免疫应答的治疗方法之一，成为肿瘤治疗的研究热点。
所有作者均声明不存在利益冲突
