研究长链非编码RNA LINC00339在结直肠癌患者中的表达情况及其对结直肠癌细胞增殖和凋亡的作用与机制。
回顾性分析2015年8月至2017年1月河南省肿瘤医院收治的经病理确证的158例结直肠癌患者。采用实时荧光定量PCR方法检测结直肠癌组织和癌旁组织中LINC00339的表达，分析LINC00339的表达与患者临床病理特征和微RNA（miR）-218表达的关系。双荧光素酶报告系统验证LINC00339与miR-218的关系。在高表达LINC00339的结直肠癌细胞LoVo和HCT116中使用siRNA干扰技术下调LINC00339，实时荧光定量PCR检测miR-218的表达、MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡。另外，在LoVo和HCT116细胞中共转染LINC00339 siRNA和miR-218拮抗剂（anti-miR-218），检测下调miR-218对LINC00339 siRNA影响的细胞增殖和凋亡的变化。
LINC00339在结直肠癌组织的表达显著高于癌旁组织（4.69±1.52比1.02±0.38，P<0.05）。LINC00339的表达与患者的年龄和性别无关（P>0.05），而与患者的TNM分期、淋巴结转移、肿瘤长径和分化程度相关（均P<0.05）。在结直肠癌组织中LINC00339的表达与miR-218的表达呈负相关性。miR-218模拟物能够显著降低野生型LINC00339质粒的荧光强度（P=0.001），但是对突变型质粒的荧光强度无影响（P=0.88）。在LoVo和HCT116细胞中下调LINC00339，细胞增殖能力受到抑制，细胞凋亡率增加（均P<0.05）；与仅转染LINC00339 siRNA相比，下调miR-218后LoVo和HCT116细胞的增殖能力增加、凋亡率降低（均P<0.05）。
LINC00339在结直肠癌中表达升高，与患者的临床病理特征密切相关。LINC00339通过下调miR-218表达促进结直肠癌细胞增殖，抑制凋亡。
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结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来，在我国其发病率和死亡率均呈现上升的趋势[1,2]。在结直肠癌早期，患者没有明显的症状，多数患者在确诊时已经处于进展期。虽然目前结直肠癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗以及靶向治疗，但是患者的5年生存率仍然较低，尤其是处于进展期的患者[3]。阐明结直肠癌的发病机制可能能为该疾病的治疗提供新的思路和方法。长链非编码RNAs（lncRNAs）是一类长度>200个核苷酸、无蛋白编码功能的RNA。越来越多的研究发现lncRNAs在多种癌症进程中发挥着重要作用[4,5,6]。LINC00339（也被称为HSPC157）是一个lncRNA，研究显示它在胶质瘤和非小细胞肺癌组织和细胞中的表达均增加，下调其表达能够抑制癌细胞的增殖和侵袭[7,8]。但是目前LINC00339在结直肠癌中的表达及作用还不清楚。本研究旨在检测LINC00339在结直肠癌组织和细胞中的表达情况，并探究下调其表达对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。
本研究为回顾性研究。收集2015年8月至2017年1月于河南省肿瘤医院初次确诊的158例行外科切除术的结直肠癌患者的新鲜结直肠癌组织和癌旁组织（与癌组织距离<2 cm）。所有患者均经病理确证，且在手术之前没有接受过化疗或放疗。将术中取得的样本用冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后立即放入-80 ℃冰箱冻存。本研究经本院伦理委员会批准（批准号：201500139）。
人结直肠癌细胞株LoVo、HT29和COLO 205为中国科学院上海生命科学研究院产品，人结直肠癌细胞株HCT116、正常结肠上皮细胞FHC和人肾胚细胞HEK293T为美国ATCC产品，RPMI-1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清均为美国Hyclone公司产品，胰酶和青霉素/链霉素双抗为美国Gibco公司产品，Trizol试剂和Lipofectamine 2000转染试剂为美国Invitrogen产品，逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒为北京康为试剂产品，MTT细胞试剂盒为上海碧云天产品，AnnexinV：FITC/PI细胞凋亡试剂盒为美国BD公司产品，LINC00339 siRNA、对照siRNA、微RNA（microRNA，miR）-218模拟物（mimics）、对照mimics和miR-218拮抗剂（miR-218 antagomirs，anti-miR-218）的核苷酸序列以及实时荧光定量PCR引物由上海捷瑞合成。
HT29、FHC和HEK293T细胞使用DMEM培养基培养，LoVo、COLO 205和HCT116细胞使用RPMI1640培养基培养。这两种培养基中均含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。将细胞置于含有5% CO2的细胞培养箱中培养。
细胞转染的操作如下：先将处于对数生长期的细胞胰酶消化后接种到细胞培养板中，待细胞融合度达到70%左右时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作，将LINC00339 siRNA、对照siRNA和anti-miR-218转染到LoVo和HCT116细胞中。
取适当大小的组织块加入到含有Trizol试剂的离心管中，用手术剪剪成碎块后使用匀浆器匀浆。对细胞则采用下面操作：先将转染72 h的细胞培养板中的上清液用移液器吸出，加入Trizol试剂，用移液器对细胞充分吹打。然后按照说明书提取组织和细胞中的总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的完整性，用Nanodrop 2000测定总RNA的浓度与纯度。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR操作，检测目的基因的相对表达量。采用公式2-ΔΔCt计算靶基因的相对表达量，LINC00339使用GAPDH为内参，miR-218使用U6为内参。本研究所用的引物序列如下：LINC00339上游引物：5′ACCATGCTAGAAAGCCTCCC3′，下游引物：5′CGTCCAGCAAGGTCCTAGAG3′；GAPDH上游引物：5′GTCAAGGCTGAGAACGGGAA3′，下游引物：5′AAATGAGCCCCAGCCTTCTC3′；miR-218上游引物：5′ACACTCCAGCTGGGTT GTGCTTGATCTA3′，下游引物：5′CTCAACT GGT GTCGTGGA3′；U6上游引物：5′GCTT CGGCAGCACATATACTAAAAT3′，下游引物：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′。
Starbase和mircode软件分析发现LINC00339与miR-218存在连续的互补配对序列，序列如下：miR-218序列3′uguaccaaUCUAGUUCGUGUu5′，LINC00339序列5′gagcucagAGCUCAAGCACAg3′（红色标记处为两者互补配对序列）。设计引物从结直肠癌组织中扩增出全长的野生型LINC00339和突变型LINC00339序列，将两者分别克隆到pGL3-Basic荧光载体中构建野生型pGL3-LINC00339-WT（LINC00339-WT）和突变型pGL3-LINC00339-Mut（LINC00339-Mut）荧光载体。将HEK293T细胞接种到24孔板中，利用转染试剂将20 nmol/L miR-218 mimics或对照mimics与0.5 μg构建的荧光质粒共同转染到接种的细胞中，细胞培养箱中孵育48 h。弃上清液，根据双重荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，检测各组细胞的荧光素酶活性。
将转染LINC00339 siRNA和对照siRNA 24 h的LoVo和HCT116细胞胰酶消化后按照1×103个/孔的密度接种到96孔板中，再分别培养24、48、72和96 h，每孔加入100 μl MTT溶液，37 ℃继续孵育4 h后再加入100 μl甲臜溶解液溶解紫色结晶，然后检测各孔570 nm波长处的吸光度（A）值。
将LoVo和HCT116细胞接种到6孔板中，转染LINC00339 siRNA、对照siRNA 48 h和（或）anti-miR-218后，按照AnnexinV：FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书操作，使用FACS Calibur流式细胞仪检测凋亡细胞。凋亡细胞包含凋亡早期与凋亡晚期细胞。
正态分布的计量资料以
±s表示，采用SPSS 13.0软件进行分析。两组间均数的比较采用student′s t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析并进行SNK检验，Pearson方法分析LINC00339与miR-218的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
LINC00339在结直肠癌组织与癌旁组织中的表达分别为4.69±1.52和1.02±0.38，其在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.001）。LINC00339在FHC细胞与结直肠癌细胞株LoVo、HT29、COLO 205、HCT116中的表达分别为0.95±0.05、6.55±0.53、2.30±0.29、2.74±0.72、5.22±0.95，与FHC细胞相比，LINC00339在LoVo、HT29、COLO 205和HCT116细胞中的表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.001，P=0.021，P=0.004，P<0.001）。
LINC00339表达与患者临床病理特征的关系见表1。LINC00339的表达与患者的年龄和性别无关（P=0.369，P=0.320），与患者的TNM分期、淋巴结转移、肿瘤长径和分化程度相关（P<0.001，P=0.010，P=0.033，P=0.002）。
LINC00339与结直肠癌患者临床症状的相关性
LINC00339与结直肠癌患者临床症状的相关性
| 临床特征 | 例数 | LINC00339表达( ±s) | P值 | |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | 0.369 | |||
| <60 | 75 | 4.6±1.4 | ||
| ≥60 | 83 | 4.8±1.6 | ||
| 性别 | 0.320 | |||
| 男 | 81 | 4.8±1.6 | ||
| 女 | 77 | 4.6±1.4 | ||
| TNM分期 | <0.001 | |||
| Ⅰ | 23 | 2.8±0.9 | ||
| Ⅱ | 59 | 4.1±0.8 | ||
| Ⅲ | 67 | 5.6±1.0 | ||
| Ⅳ | 9 | 7.2±1.3 | ||
| 淋巴结转移 | 0.010 | |||
| 是 | 72 | 5.0±1.7 | ||
| 否 | 86 | 4.4±1.3 | ||
| 肿瘤长径 | 0.033 | |||
| >4 cm | 102 | 4.9±1.5 | ||
| ≤4 cm | 56 | 4.4±1.5 | ||
| 分化程度 | 0.002 | |||
| 高分化 | 25 | 4.1±1.7 | ||
| 中分化 | 97 | 4.7±1.2 | ||
| 低分化 | 36 | 5.1±1.9 | ||
使用siRNA干扰技术下调LINC00339的表达后，LoVo细胞LINC00339 siRNA组中LINC00339表达水平显著低于对照组和对照siRNA组（0.55±0.08比1.01±0.06、0.99±0.09，均P<0.05）；HCT116细胞LINC00339 siRNA组中LINC00339表达水平显著低于对照组和对照siRNA组（0.41±0.09比0.98±0.07、1.03±0.08，均P<0.05）。MTT检测LoVo和HCT116细胞在24、48、72和96 h时的活力，如图1所示，两种细胞LINC00339 siRNA组的细胞活力显著低于对照组和对照siRNA组（均P<0.05）。
注：与对照组和对照siRNA组相比，aP<0.05
流式细胞术检测LoVo和HCT116细胞的凋亡，发现对照组、对照siRNA组和LINC00339 siRNA组中LoVo细胞的凋亡率分别为（4.35±0.79）%、（4.43±0.58）%、（17.96±3.22）%；LINC00339 siRNA组细胞的凋亡率与对照组和对照siRNA组相比显著增加，均差异有统计学意义（均P<0.001）。对照组、对照siRNA组和LINC00339 siRNA组中HCT116细胞的凋亡率分别为（5.33±0.99）%、（4.93±1.24）%、（23.13±2.48）%；LINC00339 siRNA组细胞的凋亡率与对照组和对照siRNA组相比显著增加，均差异有统计学意义（均P<0.001）。
双荧光素酶报告系统检测发现：在转染野生型LINC00339质粒的细胞中，转染对照mimics和miR-218 mimics后荧光强度分别为1.08±0.16和0.48±0.11；与对照mimics相比，miR-218 mimics显著降低了野生型LINC00339质粒的荧光强度（P=0.001）。在转染突变型LINC00339质粒的细胞中转染对照mimics和miR-218 mimics后荧光强度分别为1.04±0.15和1.03±0.14；与对照mimics相比，miR-218 mimics对突变型质粒的荧光强度无影响（P=0.88）。miR-218在LoVo细胞的对照组、对照siRNA组和LINC00339 siRNA组中的表达分别为1.00±0.14、1.03±0.13、4.07±0.48；miR-218在HCT116细胞的对照组、对照siRNA组和LINC00339 siRNA组中的表达分别为1.03±0.11、0.99±0.12、2.77±0.39。miR-218在两种细胞LINC00339 siRNA组中的表达显著高于对照组与对照siRNA组（均P<0.05）。
Pearson分析LINC00339与miR-218的相关性，结果如图2所示：两者在结直肠癌组织中的表达呈负相关（P<0.05）。
通过anti-miR-218和LINC00339 siRNA共转染，进一步探究LINC00339对结直肠癌细胞增殖和凋亡的作用机制。发现LINC00339 siRNA+anti-miR-218组中LoVo和HCT116细胞的活力显著高于LINC00339 siRNA组（均P<0.05）（图3）；LINC00339 siRNA+anti-miR-218组中LoVo和HCT116细胞的凋亡显著低于LINC00339 siRNA组（9.14±1.89比17.96±3.22，10.16±2.14比23.13±2.48，均P<0.05）。
注：与LINC00339 siRNA组相比，aP<0.05
近年来的研究显示，在多种癌症中lncRNAs是重要的促癌因子或者抗癌因子[4,5,9]。目前的研究发现LINC00339在胶质瘤和非小细胞肺癌中表达升高，它能够促进这两种肿瘤的发生和发展[7,8]。但是其在结直肠癌中的表达和作用还不清楚。本研究收集158例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织，检测其中LINC00339的表达发现，LINC00339在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织。进一步分析LINC00339的表达与患者的临床特征发现，其表达与患者的年龄和性别无关，但是与患者的TNM分期、淋巴结转移、肿瘤长径和分化程度相关。此外，本课题组发现与正常结肠上皮细胞FHC相比，LINC00339的表达在结直肠癌细胞株LoVo、HT29、COLO 205和HCT116中显著上调。这表明LINC00339在结直肠癌中可能是一个重要的促癌因子。
通过siRNA干扰技术在LoVo和HCT116细胞中下调LINC00339的表达，进一步探究LINC00339在结直肠癌中的作用。MTT检测细胞增殖，发现下调LINC00339的表达显著抑制了两种细胞的增殖。流式细胞术检测发现LINC00339下调显著增加了两种细胞的凋亡。这表明LINC00339能够促进结直肠癌细胞的增殖，抑制细胞凋亡。
研究发现，LncRNAs可通过负向调节miRs的表达，发挥其生物学作用[10,11]。近年来的文献报道，miR-218是结直肠癌中一个重要的分子。它在结直肠癌组织和细胞中的表达下调，其可抑制结直肠癌细胞周期进程、迁移和侵袭，促进结直肠癌细胞凋亡[12,13,14]。miR-218还可增加结直肠癌细胞对抗肿瘤药物——奥沙利铂和5′-氟尿嘧啶的敏感性[15,16]。因此，本研究进一步探究了LINC00339与miR-218的关系。生物信息学和荧光报告基因分析发现LINC00339能够直接与miR-218结合。在结直肠癌细胞中下调LINC00339能够上调miR-218的表达。这表明LINC00339可作为miR-218的分子海绵[8]，抑制miR-218表达。Pearson分析显示在结直肠癌组织中，LINC00339与miR-218的表达呈负相关。此外，下调miR-218的表达能够减弱LINC00339下调对结直肠癌细胞增殖的抑制和对凋亡的促进作用。这些结果表明LINC00339在结直肠癌中的作用是通过负向调节miR-218的表达发挥的。但是下调miR-218并不能完全减弱LINC00339下调对结直肠癌细胞增殖和凋亡的作用，这表明可能还存在其他调节机制。一个LncRNA可以作用于多个miRNAs，Guo等[7]的研究显示LINC00339通过调节miR-539刺激胶质瘤中血管生成拟态的形成，而且miR-539能够抑制人结直肠癌的疾病进程[17]。LINC00339负向调节miR-145的表达促进非小细胞肺癌的发生[8]，且miR-145在结直肠癌中是一个重要的肿瘤抑制因子[18]。这表明抑制miR-539和miR-145的表达可能也是LINC00339在结直肠癌中的作用途径，但是具体的作用机制有待进一步探究。
总之，本研究结果发现LINC00339在结直肠癌组织中高表达，且与患者的临床病理特征具有相关性。LINC00339可以通过下调miR-218的表达促进结直肠癌细胞的增殖，抑制凋亡。本研究表明LINC00339可能是结直肠癌潜在的分子治疗靶点，但是其在结直肠癌中具体的调控机制仍需进一步探究。
所有作者均声明不存在利益冲突
