本研究应用一种水凝胶包被肿瘤微组织块进行咽喉肿瘤体外标准化疗药物敏感性检测方法，即"果冻"药敏检测法，对2例咽喉肿瘤患者进行常用化疗方案的筛选。检测结果发现一例患者应用长春新碱、伊立替康、长春新碱+伊立替康+环磷酰胺、阿霉素疗效明显。另一例患者应用顺铂、顺铂+5-氟尿嘧啶+多西紫杉醇、顺铂+5-氟尿嘧啶、多西紫杉醇有效，其结果符合临床治疗指南。经初步探索该方法可用于肿瘤化疗药物的筛选，有望成为肿瘤标准化疗方案筛选的方法。
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咽喉肿瘤是头颈部常见的恶性肿瘤，发病率约占全身恶性肿瘤的1%~5%[1]。据统计，目前我国咽喉肿瘤的发病率呈持续上升态势[2]。由于咽喉肿瘤位置特殊，早期症状不明显，大部分咽喉肿瘤患者发现时已是中晚期，尽管近年来治疗方案不断优化，但患者5年生存率仍无明显提高[3]。
由于肿瘤本身的异质性和微环境，使同一肿瘤类型患者对肿瘤标准治疗方案的治疗效果差异明显。因此如何更有效地筛选并应用抗癌药，预测个体肿瘤对药物的敏感性，科学地指导临床治疗以提高疗效已成为目前临床化疗中需要迫切解决的问题。本研究应用"果冻"药敏检测法（国家发明专利申报过程中），可以快速、有效地进行标准治疗方案的筛选。
肿瘤样本均来自南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科。经手术切除的咽喉肿瘤患者样本，迅速装入含有组织保存液的50 ml离心管中，标本运输袋内放入冰块保持标本低温，2 h内送至实验室。肿瘤样本纳入标准：通过手术获取咽喉肿瘤原位或者转移病灶的肿瘤组织标本，预计患者生存期不少于1年并且手术后需要做一线化疗的患者。所选患者为中晚期肿瘤患者，且术后需经辅助化疗。本研究经南昌大学第一附属医院伦理委员会批准[医研伦理第（017）号]，患者均签署知情同意书。
样本保存液、"果冻"药敏检测试剂盒（均购自南昌乐悠生物科技有限公司），二甲基亚砜（DMSO）、MTT（均购自美国Sigma公司），顺铂（齐鲁制药有限公司，国药准字H37021358），紫杉醇（海口市制药厂有限公司，国药准字H20083850），氟尿嘧啶注射液（上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020593），长春新碱（郑州恒峰药业有限公司，国药准字H20068151），伊立替康（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20020687），环磷酰胺（江苏盛迪医药有限公司，国药准字H32026196），阿霉素[辉瑞制药（无锡）有限公司，国药准字H20013334]。
生物安全柜内用0.4%的锥虫蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织。然后放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30 s消毒，再用含有3%双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织。将肿瘤组织分割成2 mm×2 mm×2 mm的组织块。
取出"果冻"药敏检测试剂盒中96孔板，置于冰上使其处于低温环境，每个孔内放入1块微组织块，并注入含水凝胶的混合液，保证混合液可淹没组织。放入37 ℃，5%二氧化碳含量的细胞培养箱中孵育2~3 h，待水凝胶凝固后，加入试剂盒自带组织培养基，每孔100 μl（96孔细胞培养板），细胞培养箱中培养。
培养24 h吸弃原培养基，加入含有测试药物的完全培养基，并每24小时更换一次培养液。设置对照组：加入不含药物单纯完全培养基；药物组加入含有不同测试药物的完全培养基，对照组与药物组所用完全培养基成分完全相同。
在含有测试药物的完全培养基培养3~7 d后，吸弃含药培养基，用PBS洗涤3次，然后加入MTT溶液，6 h后将MTT溶液吸去，用眼科镊将组织块从水凝胶中取出，放入新的细胞培养孔中，再加入200 μl DMSO后震荡10 min，细胞培养板中的每个板孔中吸取100 μl溶液加入新的细胞培养板的板孔中，使用酶标仪检测每孔的吸光度（A）值。
酶标仪检测490 nm波长处的A值。药物抑制率=（1-药物组A值/对照组A值）×100%，其中依据MTT比色法检测药物敏感性判断标准为抑制率的临界值30%，抑制率<30%的药物可视为无效药物。实验重复3次，取平均值。
两例患者均为咽喉部肿瘤，基本资料见表1。患者1，男，68岁，因声音嘶哑1个月，呼吸不畅1 h入院，影像学提示：右侧杓会厌见大块不规则影，上至舌骨上缘，至环状软骨上缘，并颈部多发小淋巴结。临床诊断：喉恶性肿瘤，入院行喉全切除术+颈淋巴结择区清扫术；术后病理诊断：喉横纹肌肉瘤。患者2，男，72岁，因声音嘶哑3个月来院就诊，影像学提示：喉部占位，累及右侧声带，双侧杓会厌襞，双侧颈部多发淋巴结影。临床诊断：喉恶性肿瘤，入院行喉全切除术+颈淋巴结择区清扫术；术后病理诊断：鳞状细胞癌。
两例患者基本资料及治疗情况
两例患者基本资料及治疗情况
| 患者号 | 年龄（岁） | 性别 | 手术方式 | 病理类型 | TNM分期 | 临床分期 | 临床诊断 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 68 | 男 | 开放手术全切 | 横纹肌肉瘤 | T3N0M0 | ⅡB期 | 喉恶性肿瘤 |
| 2 | 72 | 男 | 开放手术 | 鳞状细胞癌Ⅱ级 | T3N2M0 | ⅢB期 | 喉恶性肿瘤 |
微组织块加入MTT液6 h后加入DMSO呈现显色反应，颜色越深表示组织活性越好，反之颜色越浅表示组织活性越差。经MTT液显色后，患者1：长春新碱、伊立替康、阿霉素以及长春新碱+伊立替康+环磷酰胺相对于对照组及其他药物组显色后颜色较浅，表明组织活性相对差，药物疗效明显。患者2：顺铂、多西紫杉醇以及顺铂+多西紫杉醇+5-氟尿嘧啶依据显色反应后的颜色变化表现出了明显的药物疗效（图1）。
注：A：患者1，MTT显色反应，自左向右依次为：长春新碱、环磷酰胺、伊立替康、阿霉素、长春新碱+环磷酰胺+伊立替康、长春新碱+环磷酰胺+阿霉素、长春新碱+环磷酰胺、空白对照；B：患者2，MTT显色反应自左向右依次为：空白对照、顺铂、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂+5-氟尿嘧啶、顺铂+多西紫杉醇+5-氟尿嘧啶
患者1药物抑制率为长春新碱78%，伊立替康71%，长春新碱+环磷酰胺+伊立替康69%，阿霉素61%，长春新碱+伊立替康42%，环磷酰胺21%，长春新碱+环磷酰胺+阿霉素7%，环磷酰胺及长春新碱+环磷酰胺+阿霉素在本次检测中不敏感。患者2药物抑制率为顺铂74%，顺铂+5-氟尿嘧啶+多西紫杉醇73%，顺铂+5-氟尿嘧啶68%，多西紫杉醇59%，5-氟尿嘧啶1%，5-氟尿嘧啶在本次检测中不敏感。
大量研究表明肿瘤的异质性及微环境是肿瘤治疗反应的关键因素[4,5]，也致使不同个体间的化疗效果存在差异，在多种化疗方案中难以选择患者敏感的化疗方案，从而导致治疗效果不佳。目前常用的药物敏感性检测主要为细胞培养及肿瘤模型，前者与患者肿瘤的异质性差异较大，后者虽然能更好地反映患者肿瘤的异质性，但其耗时长且花费高。本研究直接采用患者的肿瘤组织，克服了药物筛选中肿瘤异质性与微环境不一致的关键问题。在传统细胞培养技术中创新地加入水凝胶，更好地保持了患者肿瘤微组织块的活性，并且利用水凝胶提供的三维立体空间环境，保持肿瘤的微环境不被破坏[6]。在此基础上进行化疗药物敏感性检测，其结果更接近临床患者的治疗反应。并且从肿瘤获取至药物敏感性测试结束，其过程操作简单、耗时短，所需费用相对较低。
目前喉癌的化疗药物包括铂类、多烯紫杉醇类、5-氟尿嘧啶等[7,8]，横纹肌肉瘤化疗药物多为长春新碱、阿霉素、环磷酰胺、伊立替康、拓扑替康等[9]。本研究中的药物方案主要依据临床指南及临床常用方案进行选择。其中长春新碱、伊立替康、阿霉素、顺铂、多西紫杉醇对肿瘤的抑制作用明显，而环磷酰胺、5-氟尿嘧啶对肿瘤组织的抑制率较低。长春新碱、阿霉素、伊立替康、顺铂、多西紫杉醇为细胞周期抑制剂，抑制体内、外肿瘤细胞。环磷酰胺在体外没有抗肿瘤活性，其要先在肝脏经酶转化成4-羟基环磷酰胺，再经过代谢途径发挥抗肿瘤作用。5-氟尿嘧啶本身没有抗肿瘤活性，需在肝脏中经二氢嘧啶脱氢酶（DPD）分解代谢为氟尿嘧啶核苷三磷酸（FUTP）、氟脲嘧啶脱氧核苷三磷酸（FdUTP）来发挥抗肿瘤作用。在本研究中即使环磷酰胺、5-氟尿嘧啶对肿瘤组织的抑制率低，但也不排除是药物自身代谢途径的影响，这也是本研究的局限性之一。
虽然本研究通过两例样本的筛选结果，发现"果冻"药敏检测法具有快速、经济且结果与临床化疗方案疗效统一的优势，但是"果冻"药敏检测法也具有一定的局限性。作为一种体外肿瘤药物筛选法，"果冻"药敏检测法对于需体内代谢发挥肿瘤作用的药物疗效尚无法评估。如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等需体内代谢的药物，"果冻"药敏检测法无法确切评估疗效。目前该方法也存在以下问题：（1）研究样本量相对较少，尚无大量可用数据支撑研究结论；（2）尚未完成临床患者治疗后的疗效评价及相应的疗效对比；（3）该方法作为体外实验将筛选结果直接应用于临床患者尚缺乏相应的临床数据，尚需积累足够的病例及一定时间的疗效观察。但两例咽喉肿瘤患者依据上述方法进行标准化疗方案的药物敏感性检测，结果符合临床应用指南推荐方案。这表明"果冻"药敏检测法用于肿瘤化疗药物筛选具有可行性依据，有望成为肿瘤标准化治疗方案筛选的方法。
所有作者均声明不存在利益冲突
