探讨miR-106a-5p对血管内皮细胞的增殖、迁移功能的调控作用，及miR-106a-5p调节内皮细胞功能的可能作用靶点。
体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），通过逆转录实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-106a-5p在HUVEC内的表达；并通过CCK-8实验、划痕实验检测miR-106a-5p对HUVEC增殖、迁移功能的影响；通过双荧光素酶实验及蛋白印记实验验证miR-106a-5p调节内皮细胞功能的可能靶点——信号转导与转录活化因子3（STAT3）。
miR-106a-5p可抑制HUVEC的增殖功能（F=13.62，P<0.01）。同时miR-106a-5p可抑制HUVEC的迁移功能：划痕12 h后，模拟物组的划痕闭合率下调（49.93/31.31）（χ2=8.240，P<0.05）；划痕24h后，模拟物组的划痕闭合率下调（78.87/44.80）（χ2=10.50，P<0.01）。miR-106a-5p的直接靶基因为STAT3，并通过转录后作用调控STAT3的表达。
miR-106a-5p抑制HUVEC的增殖及迁移功能，其可能的作用靶基因为STAT3。
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动脉粥样硬化（AS）是一类由多病因导致的主要累及大中动脉的慢性炎症性疾病，而下肢动脉硬化闭塞症（ASO）是全身动脉粥样硬化性病变的重要组成部分，亦是血管外科的常见病，其可引起下肢长期慢性缺血，随着疾病进展，动脉管腔闭塞、侧枝循环无法代偿，最终肢体缺血、坏疽，严重者常需截肢，甚至有生命危险。
microRNAs是一类长度约21~23个核苷酸的内源性非编码小分子RNAs，通过与靶mRNA3′端非翻译区（3-untranslated region，3′-UTR）特异性结合，从而抑制该mRNA的翻译或直接降解该mRNA，以此调节蛋白质的表达[1,2]。作为AS病变重要参与者，内皮细胞（EC）、血管平滑肌细胞（VSMC）的功能均受到miRNAs的调控。本中心前期芯片结果提示，microRNA-106a-5p（miR-106a-5p）在ASO患者的血管壁表达降低[3]。本实验研究通过人脐静脉内皮细胞系探讨miR-106a-5p对内皮细胞功能的调控以及可能作用靶基因，以期为ASO的预防、治疗等带来了新的机遇。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自美国ATCC细胞库；人原代动脉平滑肌细胞分选自遗体捐赠的下肢股动脉。标本取材经中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准。
胎牛血清（FBS）、DEME培养基、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）、结晶紫粉末购自美国Sigma公司；Trizol、4%多聚甲醛、LipofectamineTMRNA iMAX转染试剂、TEMED购自美国Invitrogen公司；miR-106a-5p引物、miRNA RT Mix试剂盒、miRNA实时聚合酶链反应（Real Time-PCR）试剂盒、STAT3引物、GAPDH引物购自大连Takara公司；miR-106a-5p模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）及阴性对照物均购自广州锐博生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化工；STAT3兔抗人一抗、p-STAT3兔抗人一抗、GAPDH兔抗人一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购自美国CST公司；Dual-Luciferase®Reporter Assay System购自美国Promega公司；ox-LDL购自广州奕源生物公司。
将细胞种于25cm2培养瓶中，采用10%FBS DMEM完全培养基，置于培养箱（37℃、5%CO2）中培养。每2~4天换液1次（根据细胞状态、密度及培养基颜色决定换液频率）。在普通倒置显微镜下观察细胞的生长状态，并根据实验目的，对细胞进行分组、种板，并予不同处理（如Ox-LDL刺激、转染、RNA提取、蛋白提取等）。
将细胞按0.5~1.5×106个/孔均匀种于6孔板中，置于培养箱中培养（37℃、5%CO2），每2~3天换液1次，待细胞密度达80%~95%时，更换培养基为DMEM，并根据既往文献报道，选取60μg/ml ox-LDL刺激内皮细胞[4,5]。
使用RNAiMAX转染试剂将miR-106a-5p mimic、抑制剂及模拟物阴性对照（NC）分别转染进生长状态良好、细胞密度达60%~70%的HUVEC，备后续实验。
制备miR-106a-5p引物，按照Trizol法提取细胞总RNA，使用miRNA RT Mix试剂盒及mRNA RT Master Mix进行逆转录，同时miRNA Real Time-PCR试剂盒进行聚合酶链反应。
将生长状态良好的HUVEC种于96孔板（5 000~6 000个/孔），培养箱（37℃、5%CO2）中培养约24 h后，进行转染（miR-106a-5p mimic及NC）；8~12 h后，更换1% FBS DMEM饥饿24 h；更换10%FBS DMEM完全培养基继续培养24 h；弃去培养基，每孔加入100 μl细胞增殖毒性检测试剂盒（CCK-8）溶液（CCK-8试剂：10%FBS DMEM=1∶9）；以锡纸包裹培养板（避光），继续培养，1~4 h后使用酶标仪检测各孔的吸光度（A）值（酶标仪调至450nm波长）。
将处于对数生长期的HUVEC种于6孔板（0.5~1.5×106个/孔），培养箱（37℃、5%CO2）中培养约24 h后，进行转染（miR-106a-5p mimic及negative control）；转染8~12 h后，予10%FBS DMEM培养；至细胞密度达95%~100%时，更换1%FBS DMEM饥饿24 h；以200 μl无菌枪头，在每孔纵向划痕；弃去旧培养基，更换10%FBS DMEM完全培养基，在0、6、12、24h时于倒置荧光显微镜（白光）下观察拍照倒置。
以蛋白裂解液提取细胞总蛋白，检测各样本蛋白浓度并配平；使用8%、10%分离胶及5%积层胶进行蛋白印记实验，转膜并孵育一抗、二抗后进行曝光。
miR-106a-5p的碱基序列为AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG，通过TargetScan、miRBase等数据库预测发现，STAT3具有3个能够与miR-106a-5p碱基互补（UUUCACG）的位点（158~164、448~454、623~629），提示STAT3可能是miR-106a-5p的靶基因。构建含有目的DNA片段（STAT3）的野生载体及突变载体（GCACTTT突变为CGTGAAA），其中突变载体含有上述3个位点的突变；位点一（252~258）、位点二（542~548）、位点三（717~723）。双荧光素酶报告体系（Dual-Luciferase®Reporter Assay System）验证miR-106a-5p与STAT3的靶基因关系。
结果以SPSS 19.0统计分析软件进行分析。分析前检验数据的方差齐性，方差齐时使用t检验或方差分析；方差不齐时使用校正t检验；均数间的两两比较，应用Bonferroni法检验。P<0.05为差异有统计学意义。
miR-106a-5p在HUVEC中的表达较其在血管平滑肌细胞中的表达丰富（4.41/1.00）（图1），差异有统计学意义（t=4.964，P<0.05）。
1：血管平滑肌细胞；2：人脐静脉内皮细胞
ox-LDL刺激HUVEC建立体外内皮损伤模型，结果显示，经过ox-LDL刺激后，HUVEC中miR-106a-5p的表达量下降（F=54.34，P<0.001）；经过ox-LDL刺激12 h后，miR-106a-5p的表达下调1.85倍（1.00/0.54）（t=7.820，P<0.05），刺激24 h后，miR-106a-5p的表达下调2.39倍（1.00/0.42）（t=9.881，P<0.05），但是ox-LDL刺激HUVEC 12 h与24 h后，miR-106a-5p的表达差异无统计学意义。
miR-106a-5p可抑制HUVEC的增殖功能（F=13.62，P<0.01），但抑制作用并不显著，且与miR-106a-5p的模拟物（mimic）浓度相关。与阴性对照组相比，转染不同浓度（50、100 nmol/L）的miR-106a-5p模拟物后，HUVEC增殖功能受到抑制（1.309/1.126、1.309/1.125）差异均具统计学意义（t=3.446、3.460，P<0.05）；但转染20 nmol/L的模拟物后，HUVEC的增殖功能则无明显改变（1.309/1.240），差异无统计学意义。
miR-106a-5p可抑制HUVEC的迁移功能（图2、图3）。划痕12、24 h后，模拟物组的划痕闭合率较空白对照组分别下调（49.93/31.31、78.87/44.80），差异均有统计学意义（χ2=8.240，χ2=10.50，P<0.05）。
1：模拟物阴性对照组1；2：miR-106a-5p模拟物；3：模拟物阴性对照组2；4：miR-106a-5p抑制剂
miR-106a-5p（previous ID：miR-106a）的碱基序列为AAAAGUGC UUACAGUGCAGGUAG，通过TargetScan、miRBase等数据库预测发现，STAT3具有3个能够与miR-106a-5p碱基互补（UUUCACG）的位点（158~164、448~454、623~629），提示STAT3可能是miR-106a-5p的靶基因。构建含有目的DNA片段（STAT3）的野生载体及突变载体（GCACTTT突变为CGTGAAA），其中突变载体含有上述3个位点的突变：将靶序列位点一：GCACTTT突变为CGTGAAA（252~258）、位点二：GCACTTT突变为CGTGAAA（542~548）、位点三：GCACTTT突变为CGTGAAA（717~723）。共转染miR-106a-5p模拟物和野生型STAT3 3′UTR质粒后（WT-STAT3 3′UTR），HEK 293细胞的荧光素酶活性降低（3.148/1.782），差异有统计学意义（F=7.837，P<0.05）；共转染miR-106a-5p mimic和突变型STAT3 3′UTR质粒后（MUT-STAT3 3′UTR），HEK 293细胞的荧光素酶活性无明显改变（F=1.980，P>0.05），因此miR-106a-5p的靶基因可能为STAT3。共转染miR-106a-5p模拟物和野生型STAT3 3′UTR质粒后HEK293细胞的荧光素酶活性降低。
与阴性对照组相比，50 nmol/L及100 nmol/L的miR-106a-5p模拟物均对STAT3的mRNA表达无明显影响（t=0.0835/0.2038，P>0.05）（图4）。
1：空白对照组；2：模拟物阴性对照组：3∶50 nmol/L的miR-106a-5p模拟物；4：：100 nmol/L的miR-106a-5p模拟物
miR-106a-5p模拟物（50、100 nmol/L）抑制STAT3的蛋白表达（F=11.16，P<0.01），同时STAT3磷酸化形式p-STAT3的蛋白表达亦下调（F=6.305，P<0.05）（图5）。而miR-106a-5p抑制物可上调STAT3的蛋白表达（F=19.70，P<0.01）（图6）。
1：空白对照组；2：模拟物阴性对照组：3∶50nmol/L的模拟物；4：100nmol/L的模拟物
1：空白对照组；2：模拟物阴性对照组：3：miR-106a-5p抑制剂（100 nmol/L）
构建STAT3的干扰RNA（siRNA），通过划痕实验显示，在siRNA沉默STAT3后，HUVEC的迁移功能受到抑制（图7）。划痕12 h后，siRNA组的划痕闭合率较空白对照组下调（46.53/22.71），差异有统计学意义（χ2=9.50，P<0.01）；划痕24 h后，siRNA组的划痕闭合率较空白对照组下调（86.54/48.18），差异有统计学意义（χ2=10.82，P<0.01）。
在AS的发生、发展过程中，EC发挥了重要作用，当EC在多种因素作用下发生功能失调，被激活的EC表达多种白细胞黏附因子，致单核细胞/巨噬细胞募集于血管内膜表面并迁移进血管壁，之后泡沫细胞形成、脂质条纹积累、VSMC迁移聚集、纤维帽形成[6,7,8]。同时EC的增殖、迁移与血管生成密切相关。而新生血管一方面可以增加缺血组织的血流灌注，另一方面亦在促进动脉粥样斑块增大、破裂等病理过程中扮演重要角色[9,10]。
STAT3是由STAT3基因编码的转录因子，属于STAT家族，STAT与其上游Janus kinase（JAK）构成JAK/STAT信号通路，影响其下游多种基因的表达，参与多种病理生理过程[11,12]。JAK/STAT通路和细胞炎症以及血管生成关系密切。已有研究证实，在动脉硬化组织中，JAK/STAT通路处于激活状态[13]；干扰素（IFN）-γ和TLR4间通过STAT1的沟通形成了信号网络，从而将促AS的作用进一步放大[14]。
本中心前期数据芯片显示，miR-106a-5p在ASO者的血管壁表达降低[3]，内皮细胞及平滑肌细胞均参与构成血管壁，由于捐赠标本获取有限，因此在体外实验中，选取人脐静脉内皮细胞系及原代培养的人平滑肌细胞进行qRT-PCR分析显示，miR-106a-5p在人脐静脉内皮细胞系中表达较为丰富，因此本研究优先选择在人脐静脉内皮细胞系中探讨miR-106a-5p的功能。通过体外实验证实miR-106a-5p抑制内皮细胞的增殖及迁移，可认为其作为血管生成抑制因子，通过在ASO患者的血管壁中表达下调发挥一定的血管保护作用。进一步的双荧光素酶报告，及针对靶基因STAT3的干扰实验，则显示miR-106a-5p可能通过靶基因STAT3调解内皮细胞的迁移等功能参与疾病的进展，这与既往研究相符[13,14]。但下肢动脉硬化闭塞症的疾病过程由多种细胞及介质参与，同时在疾病的不同阶段内皮细胞可能发挥不同的功能，因此miR-106a-5p在ASO患者中的作用尚需进一步的体内实验探索。
所有作者均声明不存在利益冲突
