随着精准医学时代的到来，肿瘤的诊治越来越强调个体化与精确性。作为液体活检最具代表性的指标之一，循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）在肿瘤诊治中的价值始终是研究的热点。搜索2016至2018年ClinicalTrial网站注册的临床研究，ctDNA相关的研究达95项，远远超过循环肿瘤细胞（CTC）（52项）及外泌体（15项）。ctDNA临床试验相较于CTC及外泌体具有更丰富的研究方向，包括早期诊断、伴随诊断、疾病监测、耐药监测、免疫治疗监测等。2017年美国临床肿瘤学学会（ASCO）及美国病理学家协会（CAP）的专家就已经关注到ctDNA的临床应用价值^[1]，呼吁开展高质量的临床研究，为ctDNA的实用性和有效性增添证据。近期，Nature Medicine、JAMA Oncology、Clinical Cancer Research等杂志先后发表了数篇ctDNA相关的高质量临床研究结果，为ctDNA在临床应用中的价值以及发展前景提出了新的观点和研究思路。

随着肿瘤靶向治疗的飞速发展，推动了肿瘤精准化管理的需求。2016年食品药品监督管理局（FDA）基于ENSURE研究结果批准了首个伴随诊断试剂盒：cobas EGFR Mutation Test v2（Roche Molecular Diagnostics），可用于检测肺癌患者ctDNA中的EGFR突变，指导靶向药物的选择^[2]。ENSURE试验中肿瘤组织EGFR突变者，血浆EGFR突变的检出率为76.7%，ctDNA检出率存在一定的假阴性^[1]。目前美国国立综合癌症网络（NCCN）指南推荐在非小细胞肺癌中，若组织标本无法获得，可通过检测ctDNA突变情况指导治疗。从指南推荐可知，ctDNA仍是肿瘤组织不可获得时的"替代选择"。随着ctDNA技术的不断改进，目前研究显示^[3]，肺癌中ctDNA对比肿瘤组织检测特定基因，已经能够达到相当高的一致性。来自中国学者发表的一项研究发现^[4]，晚期初诊非小细胞肺癌患者中ctDNA与组织检测EGFR突变的一致性高达88%。2017年ASCO及CAP对ctDNA进行了一项联合评述，旨在评价肿瘤ctDNA检测的临床证据^[1]。该评述指出，既往评价ctDNA临床有效性的研究主要是回顾性数据，缺乏前瞻性研究证据。正因如此，ctDNA始终处于二线，无法正式替代组织成为一线检测手段。近年来，已有不少前瞻性研究试图回答：ctDNA是否能够替代组织成为一线检测方式？

2018年发表的BENEFIT是一项前瞻性的Ⅱ期临床试验，旨在评价基线ctDNA中EGFR突变阳性是否可以作为筛选标准决定晚期肺腺癌的一线吉非替尼治疗，为血浆ctDNA检测指导靶向治疗提供了更高级别的循证医学证据^[5]。研究发现ctDNA检测出EGFR突变的患者，接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）治疗的客观缓解率约70%。此外，治疗8周EGFR突变清除可预测吉非替尼早期耐药，提示动态检测ctDNA同样具有一定的价值。

2019年发表于Clinical Cancer Research的NILE研究^[6]，探索了ctDNA在初诊晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中取代组织作为一线检测手段的价值，发现在89例驱动基因阳性的初诊晚期NSCLC患者中（驱动基因阳性指：指南推荐的8种生物标志物中，至少一项阳性），如果先行ctDNA检测，可识别出87%的阳性患者，而先行组织检测，反而仅识别出67%。该研究首次证实了ctDNA检测或许可作为先于组织的一线检测选择。NILE研究中，ctDNA检测的准确性不仅达到了研究预设目标，而且检测报告时间（9 d）较组织检测（15 d）大大缩短。但是ctDNA检测也有局限性，对于染色体重排的检测效果欠佳（如ROS1重排），这是今后技术上需要克服的难点。

2019年发表于Nature Medicine的TARGET研究^[7]，旨在讨论ctDNA检测在药物临床研究中的可行性及潜在价值。本次公布的Part A结果纳入了100例患者，涵盖22个肿瘤类型。研究中ctDNA检测结果与组织检测呈现良好的一致性。41%（41/100）的患者检测出了靶点基因突变，其中11例患者接受了突变靶点对应的靶向治疗，疾病控制率达到了100%，缓解率达到36.4%（4/11）；而未接受对应靶点治疗的17例患者，疾病控制率仅23.5%（4/17），缓解率为0%。TARGET研究再次证实ctDNA作为伴随诊断或补充诊断，可指导肿瘤患者的治疗选择，并给患者带来生存获益。

ctDNA实现用药指导，需要考虑合理的基因组合以及适当的检测时机。覆盖的基因靶点应当有明确的治疗药物，推荐检测的时间点应是在接受抗肿瘤治疗前。上述研究结果均证实了ctDNA替代肿瘤组织成为一线选择的可行性，ctDNA作为伴随诊断的适用范围将得到更大的拓展。但上述研究证据仅仅来自于非小细胞肺癌，在其他瘤种中的价值仍有待研究。ctDNA作为伴随诊断依然面临一些问题，包括：检测重排的能力有待提高、靶点对应的药物不可得等，但随着检测技术的发展以及新药研发，上述问题将逐步解决。

既往研究发现ctDNA的含量与肿瘤负荷呈正相关，由于ctDNA的半衰期短（2.5 h），因此能够实时反映肿瘤负荷^[8]。以往的研究主要关注于ctDNA在晚期实体瘤中的疗效预测及预后判断价值^[9,10]。但近年来，研究者们逐渐尝试将ctDNA的临床应用提前到早期实体瘤患者，尤其是围手术治疗期间的应用，比如检测微残留病灶（MRD）、发现隐匿性转移等（表1）。近期JAMA Oncology先后发表了3项研究结果^[11,12,13]，为ctDNA在术后复发监测的应用价值提供了新的循证依据。

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表1

ctDNA在检测肿瘤微残留病灶中的研究

表1

ctDNA在检测肿瘤微残留病灶中的研究

发表时间	癌种	例数	检测基因个数	检测基因	检测时间	检测结果
2017	肺癌	24	12~30 （SNVs）	基于组织NGS	术后，1次/ 3个月	ctDNA中SNV检测与非小细胞肺癌复发相关。ctDNA检测早于临床和放射学检测疾病复发的中位时间为70 d[14]
2017	肺癌	40	128	-	治疗前及治疗后，1次/3~ 6个月	在94%复发患者中，ctDNA可在治疗后的第1份血液样本中检测到。72%的患者ctDNA检测先于放射检查进展，中位时间为5.2个月[15]
2016	结直肠癌	230	15	SMAD4、TP53、AKT1、APC、BRAF、CTNNB1、ERBB3、FBXW7、HRAS、KRAS、NRAS、PIK3CA、PPP2R1A、RNF43、POLE	术后4~ 10周	178例患者中，仅14例（7.9%）术后检测到ctDNA，其中11例（79%）复发，164例ctDNA阴性患者中只有16例（9.8%）复发（HR=18, 95%CI: 7.9~40,P<0.001）[16]
2017	结直肠癌	45	1	KRAS	术前及术后3个月	所有复发的患者，术后都监测到ctDNA，比CT检查更早发现复发，平均提前9.4个月。所有未复发的患者均未检测到ctDNA[17]
2019	结直肠癌	130	5	基于组织全外显子测序，KRAS、PIK3CA、SMAD4、ERBB2、BRAF	术前，术后30 d，1次/ 3个月	术后30 d ctDNA阳性患者复发率是ctDNA阴性患者的7倍（HR=7.2, 95%CI: 2.7~ 19.0,P<0.001）。新辅助化疗后ctDNA阳性患者复发率是阴性者17倍（HR=17.5, 95%CI: 5.4~56.5,P<0.001)。随访期间，ctDNA阳性患者复发率是阴性患者的40倍以上（HR=43.5,95%CI: 9.8~193.5P<0.001)[12]
2019	结直肠癌	58	15	SMAD4、TP53、AKT1、APC、BRAF、CTNNB1、ERBB3、FBXW7、HRAS、KRAS、NRAS、PIK3CA、PPP2R1A、RNF43、POLE	术后1个月，1次/3~ 6个月	ctDNA阳性患者的复发率为77%（10/13）。ctDNA检测先于放射学和临床证据复发3个月。在整个随访期间45例ctDNA阴性的患者中，无1例复发[11]
2019	黑色素瘤	162	5	BRAF、NRAS、TERT、TP53、KIT	术前，术后12周，1次/ 6个月	术前基线及术后ctDNA检测均能预测术后复发的高危患者（基线HR=2.9, 95%CI; 1.5~5.6,P<0.002；术后HR=10, 95%CI: 4.3~2 4,P<0.001）[18]
2015	乳腺癌	55	1	基于组织dPCR	术后2~4周	术后ctDNA状态与肿瘤复发风险高度相关，术后单点与多点监测：预测复发敏感度为50%与80%[19]
2017	乳腺癌	38	1	TP53	新辅助化疗期间，术后2~10周	基线时，75%(27/36）的患者检测到ctDNA。新辅助治疗期间ctDNA水平升高的患者均出现肿瘤进展。新辅助治疗1周期后，ctDNA阳性与较短的无病生存期（P<0.001）和总生存期（P<0.006）相关[20]
2019	乳腺癌	49	16 （位点）	基于组织全外显子测序	1次/6个月	18例出现复发的患者中，16例检测到血浆ctDNA（敏感度为89%）；ctDNA检测复发早于临床或影像学检查的中位时间为2年。31例未复发的患者中，任何时间点ctDNA检测均阴性（特异度为100%)[21]
2019	乳腺癌	33	8	AKT1、EGFR_1、EGFR_2、GNA11 IDH1、PDGFRA、PIK3CA、RET	新辅助治疗前及治疗后	新辅助治疗后疾病残留患者的ctDNA含量高于病理完全缓解的患者（0.017%、0.003%）。治疗后ctDNA的含量能够有效提供疾病残留的信息[22]

注：SNVs：单核苷酸变异；NGS：下一代测序；ctDNA：循环肿瘤DNA；dPCR：数字PCR；"-"具体检测基因文中没有提及

2019年5月发表在JAMA Oncology上的一项回顾性研究^[11]，旨在评估ctDNA监测结直肠癌术后复发的价值。该项研究纳入了58例患者，共收集了319份血液样本。其中，ctDNA阳性患者复发率为77%（10/13例），ctDNA阴性的45例患者中，无1例复发。3例ctDNA阳性且未复发的患者，其ctDNA在随访期间均下降到了无法检测的水平。此外，研究发现ctDNA阳性先于放射学和临床证据的复发，中位提前时间为3个月。

2019年发表于JAMA Oncology上的另一项前瞻性研究中^[12]，纳入125例结直肠癌患者，收集795份血液样本，分别在术前14 d内、术后30 d、以及后续每3个月1次检测ctDNA，旨在动态监测ctDNA，评估其在早期发现肿瘤复发中的价值。研究发现无论是术后30 d、辅助化疗结束后或是随访期间，ctDNA阳性组的复发风险均较阴性组明显提高；其中，随访期间ctDNA阳性患者的复发风险较阴性患者高出40倍。该研究证实了ctDNA在结直肠癌术后复发监测方面具有重要的价值，尤其是连续、多点、动态监测ctDNA能够很好地筛选出高复发风险的患者。

2019年8月发表于JAMA Oncology上的一篇前瞻性研究^[13]，评估了ctDNA在早期乳腺癌中的复发监测价值。研究纳入了101例接受根治术的早期乳腺癌患者，在确诊时以及随访期间连续、多点地检测ctDNA。研究结果发现随访期间ctDNA阳性患者的复发风险明显高于ctDNA阴性患者。与确诊临床复发时间相比，检出ctDNA阳性的时间平均提前10.7个月。

值得注意的是，上述2项前瞻性研究，均是通过肿瘤组织的突变来设计个体化检测组合，这就带来了一个不可避免的技术问题：如何在将来的应用中实现ctDNA检测组合的标准化？此外，目前ctDNA在早期复发监测方面的研究主要集中于结直肠癌以及乳腺癌，而对于其他实体瘤，ctDNA是否也具有同等的价值，还不得而知。上述研究虽然提示我们ctDNA在预测早期复发方面具有重要的价值，然而仍有许多问题需要解决。如何制定ctDNA检测的时间及频率？如何指导肿瘤患者后续的治疗方案？基于ctDNA的治疗决策是否能给患者带来生存获益？这就需要更多前瞻性研究来验证ctDNA指导临床决策的价值，从而促进ctDNA实现临床转化。

近年来，免疫治疗的飞速发展，给传统肿瘤治疗模式带来了巨大变化。免疫治疗与传统抗肿瘤药物相比具有许多特殊性：泛瘤种性、独特的生物标志物、特殊的疗效反应等。目前肿瘤免疫治疗方面尚缺乏方便、有效的疗效预测标志物。基于肿瘤组织检测的肿瘤突变负荷（TMB）被认为是预测免疫治疗疗效的重要标志物。2019版NCCN肺癌指南首次将TMB作为2A类推荐，而液体活检因为克服了组织样本的限制，血浆TMB（bTMB）的检测和评估也成为了临床关注的重点，近期相关研究结果见表2。

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表2

血浆TMB在肿瘤免疫治疗中的研究

表2

血浆TMB在肿瘤免疫治疗中的研究

发表时间	瘤种	例数	检测平台	结果
2019	肺癌	98	NCC-GP150	NCC-GP150检测的血浆肿瘤突变负荷（bTMB）与全外显子测序计算的组织肿瘤突变负荷（tTMB）具有较高的一致性，bTMB≥6与晚期非小细胞肺癌患者免疫治疗的疗效呈正相关[23]
2018	肺癌	259	Foundation One （F1）CDx NGS Panel	tTMB和bTMB检测结果呈正相关（Spearman等级相关系数为0.64；95%CI：0.56~ 0.71）。高bTMB（≥16）与免疫治疗的临床获益密切相关[24]

注：TMB：肿瘤突变负荷；tTMB：组织TMB；bTMB：血浆TMB

2018年发表于Nature Medicine的研究发现^[24]，同一例患者的组织TMB（tissue TMB，tTMB）和bTMB呈显著正相关，阳性一致率（PPA）为64%，阴性一致率（NPA）为88%。高bTMB患者接受免疫治疗的预后更佳。2019年2月，中国学者首次系统建立了NGS检测组合计算bTMB的理论模型，为无创检测指导肺癌免疫治疗增添了有力证据，相关研究成果发表于JAMA Oncology^[23]。

ctDNA在免疫治疗时代的价值不仅局限于筛选获益人群，还能够协助判断免疫治疗疗效。由于免疫治疗的原理不同于放化疗及靶向治疗，传统基于影像学检查的RECIST标准可能并不是免疫治疗疗效评估的最佳方案。因此，专家学者们越来越关注于ctDNA在免疫治疗疗效评估方面的价值，相关研究结果见表3。2018年发表于Clinical Cancer Research上的一项研究使用ctDNA监测28例接受免疫治疗的晚期NSCLC患者，开始治疗后每2周收集患者血液样本进行NGS检测，同时每6~12周收集影像学资料，结果发现达到ctDNA缓解（ctDNA突变丰度自基线下降50%以上）的患者更容易临床获益^[25]。

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表3

ctDNA丰度检测在免疫检查点抑制剂疗效评估中的研究

表3

ctDNA丰度检测在免疫检查点抑制剂疗效评估中的研究

发表时间	瘤种	例数	检测方法	结果
2018	肺癌	23	NGS	首次肿瘤评估时ctDNA浓度以及ctDNA治疗过程中浓度变化与疗效、临床获益和PFS相关。免疫治疗2个月时ctDNA浓度未增加> 9%的患者能够取得PD-1单抗治疗的长期获益[26]
2018	肺癌	28	NGS	治疗后ctDNA突变等位基因比例下降>50%定义为ctDNA应答。ctDNA应答与影像学检测结果高度一致。ctDNA应答者具有更长的PFS和OS。治疗期间ctDNA下降是免疫治疗有效的早期指标[25]
2017	肺癌	14	NGS	接受免疫治疗2周后，代表性等位基因频率的变化与治疗疗效的一致性达100%[27]
2017	黑色素瘤	53	ddPCR	黑色素瘤患者接受免疫治疗前及12周时，检测ctDNA水平的变化能预测疗效，其敏感度为79%、特异度为94%、阳性预测值为98%、阴性预测值为59%[28]
2018	黑色素瘤	125	ddPCR	29例进展的患者中，假性进展9例，真性进展20例。所有假性进展的患者都具有良好的ctDNA变化趋势（基线时阴性或治疗后下降>10倍)。ctDNA水平变化预测假性进展的敏感度为90%，特异度为100%[29]
2017	多瘤种	66	NGS, bi-PAP, ddPCR	免疫治疗8周后，ctDNA水平与肿瘤大小的变化存在显著相关性（r=0.86，P=0.002）。ctDNA降至阴性者具有显著且持久的治疗反应。因此，8周后ctDNA变化是预测免疫治疗患者预后的重要因素[30]

注：ctDNA：循环肿瘤DNA；NGS：下一代测序；ddPCR；微滴式数字PCR；bi-PAP：双向焦磷酸化活化聚合PCR；PFS：无进展生存期；OS：总生存期

近年来研究发现，免疫治疗过程中会出现假性进展的现象，是指首次免疫治疗后影像学检查提示肿瘤明显增大（根据WHO或RECIST标准评定为疾病进展），但继续接受免疫治疗肿瘤保持稳定、缩小或消失。不同肿瘤中均会出现免疫治疗相关的假性进展，据报道恶性黑色素瘤中的发生率为2.8%~15.8%，非小细胞肺癌0.6%~5.8%，头颈部鳞癌约1.8%，泌尿系统肿瘤1.5%~7.1%，间皮瘤约6.9%，肾癌5.7%~8.8%，默克尔细胞癌约1.1%。目前的观点认为，假性进展可能是由于免疫治疗后肿瘤组织中大量免疫细胞和炎细胞浸润导致肿瘤"假性增大"。及时识别假性进展对于患者的后续治疗至关重要，误以为是真性进展将导致患者错失有效的免疫治疗。2018年发表在Am J Cancer Res的一项研究证实了ctDNA能够识别免疫治疗过程中的假性进展^[29]。该研究纳入了125例接受免疫治疗的Ⅳ期黑色素瘤患者，根据ctDNA治疗前后变化分为2组：（1）良性ctDNA变化：基线和治疗过程中均未检测到ctDNA，或治疗后转阴，或治疗后浓度下降10倍以上；（2）恶性ctDNA变化：基线可检测到ctDNA且治疗过程中ctDNA丰度保持稳定或增加。真性进展的20例患者中，18例患者（90%）的ctDNA丰度变化谱属于恶性，而假性进展的9位患者中，ctDNA丰度变化谱均为良性。采用ctDNA丰度来识别假性进展的敏感度为90%，特异度为100%。

上述研究证实了ctDNA在肿瘤免疫治疗的获益人群筛选以及辨别假性进展方面具有一定的价值。因此免疫治疗前后，接受ctDNA检测均有一定的价值，而具体检测组合以及检测时间点尚无明确的定论。ctDNA在免疫治疗领域的应用仍面临许多问题。首先，bTMB检测需要很大的检测组合，而且存在假阳性率较高等问题。此外，除了肺癌，tTMB对免疫治疗疗效的预测作用在其他实体瘤中并没有达到预期想象^[31]。上述问题都会给bTMB的临床应用带来较大的阻碍。而目前免疫治疗假性进展方面的研究，仍是以小样本、回顾性研究以及案例报道为主，缺乏有力的循证依据。

尽管如此，肿瘤免疫治疗领域仍是液态活检不可忽略的方向。免疫治疗获益人群的筛选、疗效评估、不良反应检测等问题仍困扰着每一位临床医师。bTMB以及ctDNA丰度目前是该领域研究较多的指标，但距离临床应用尚需要大型、前瞻性的临床研究证实。

近年来，ctDNA相关研究非常显著的趋势是逐渐从"实验室基础研究"走向"临床试验"。越来越多研究者开始探索ctDNA的临床应用价值。ctDNA的时代已经到来，我们是否准备就绪^[32]？选择何种ctDNA检测指标及方法、应用于何种临床场景、怎样设计合理的临床试验，是ctDNA研究中的重点及难点。换言之，ctDNA的价值不在于有或无，而是在哪里。目前仍需要重点研究的内容包括：如何设计ctDNA检测的标准化检测组合？如何规范化地选择检测的时间点？如何基于ctDNA检测结果指导肿瘤患者的治疗？如何应用ctDNA检测给患者带来生存获益？因此，我们迫切期待能有更多基于ctDNA质和量的变化进行临床干预的前瞻性研究，从而验证ctDNA的临床价值。