核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊的重要手段，但是目前临床上反映存在较高比例核酸检测假阴性的问题。本文将明确核酸检测假阴性的概念，并分析造成核酸检测假阴性的原因。在核酸检测基础上，补充新型冠状病毒特异性IgM/IgG抗体的联合动态多次检测，可以明显减少有病毒性肺炎临床症状和影像学证据、但核酸多次或始终检测为阴性的临床层面上的假阴性，对临床诊断病例的最终确诊和准确性评价具有重要意义。
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新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）由RNA核酸和蛋白等组成，RNA很容易降解，蛋白衣壳将RNA包裹在其中，加上一层由脂质和糖蛋白组成的包膜，从而使其RNA得到保护[1]。2019-nCoV通过细胞表面的血管紧张素转换酶2 （angiotensin converting enzyme Ⅱ，ACE2）受体入侵细胞造成感染，并且利用宿主细胞进行复制增殖[2]。因此可以通过采集人的特定部位细胞标本，检测其中是否含有病毒RNA核酸，来确认机体是否受到感染。
核酸是由4种不同碱基排列而成，不同病毒的核酸碱基排列方式，就像发报的密电码，各有不同。检测RNA病毒核酸最为常用的方法是实时荧光RT-PCR。病毒核酸测序则主要用于病毒序列分析、进化及变异研究。核酸检测就像分析密电码，2019-nCoV也有其特异的密电码，并且与其他冠状病毒具有一定的同源性，其中与SARS病毒同源性约80%，与中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）同源性约50%[3,4]。2019-nCoV约3万个碱基（29 870 bp，GenBank号：MN908947）[5]，不同区域和其他冠状病毒序列的相似性有所不同，如2019-nCoV和SARS冠状病毒在E区域相似度达93%[3]，因此核酸检测试剂往往选择相似度低的区域进行，这样就可以特异地识别2019-nCoV[6]。区域的识别，通过引物和探针的结合来实现，因此试剂中的探针和相应区域的高度匹配决定了病毒核酸检测具有很好的特异性，一旦检测到，即为阳性，证明有病毒的存在。通常我们说病毒核酸检测是确诊感染的"金标准"，这个"金标准"就是指阳性结果。至于假阳性，则通常是由于实验室人员操作时，发生了标本间交叉污染或实验室扩增产物的遗留污染所致，在目前严格执行"三个阴性样本随机放在临床标本中间同时参与检测全过程"的质控策略下，可有效避免假阳性结果，这也是阳性结果可以作为确诊依据之所在[7]。但另一方面，如果检测结果为阴性，则不能作为判断患者未被感染的"金标准"。这是因为在被感染者中检出核酸，需同时满足以下4个条件，即（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒；（2）采集标本时，必须采集到含有病毒的细胞；（3）可靠的体外诊断试剂；（4）规范的临床核酸检测实验室（合理的分区、有能力的检测人员和严格的质量管理体系）。
目前激烈讨论的临床医生反映强烈的核酸检测假阴性概念，往往指的是患者的临床症状及影像学证据高度疑似新型冠状病毒肺炎，而2019-nCoV核酸检测多次或始终为阴性。但对于核酸检测试剂和临床实验室来说，核酸检测假阴性概念则有所不同，指的是所采集标本中存在有足够量的病毒，但却没有被检出，而不是上述临床医生所称的核酸检测结果与临床表现不符的假阴性。要想尽可能避免假阴性，首先要解决的是"被感染者的细胞中有一定量的病毒、采集标本时采集到含有病毒的细胞"这两个环节的问题。
机体被病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，感染者大部分会经历潜伏期、轻度症状至自愈或治愈的过程，少部分患者会出现严重症状。不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同，是因为这些部位细胞所含病毒受体占比不同所致。初步研究表明，2019-nCoV感染，肺泡上皮细胞的病毒受体表达占比最高，气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等则占比较低。因此，下呼吸道的病毒量明显高于上呼吸道。此外，国内外也有在2019-nCoV感染者粪便标本中检出病毒的报道[8,9]，但是检出率尚不明确。总的来说，肺泡灌洗液中最容易检出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。因为操作的方便性和患者的接受程度，目前临床最常用的标本是口咽部拭子，其次是鼻咽部拭子，而在某些患者中，口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低，如果只取口咽部或鼻咽部标本检测，病毒核酸就检测不到。尽管肺泡灌洗液更容易检出核酸，由于其操作的复杂性和患者的接受程度差，难以作为常规采样方法。因此，一个特定的疑似感染患者，不同的病期，在不同的身体部位出现病毒与否及出现的浓度会有差异，如咽部没有，痰或者粪便中可能有，如能同时或在疾病过程中的不同时间采取上述多种标本进行检测，会有助于假阴性的避免。
理论上，目前的国家药品监督管理局批准试剂都包含检测人细胞中核酸序列的内对照[10]，例如含有一个单链RNA分子的核糖核酸酶P （ribonuclease P，RNase P）[11]。内对照可以监测是否采集到足够量的细胞。但是，采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够；采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等，则可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞，也会造成假阴性。通过制订各种标本采集的标准操作程序（可文字加图示），并依其加强对标本采集人员的培训及考核后上岗，可以在很大程度上解决该问题。
体外诊断试剂的可靠性非常重要。如前所述，2019-nCoV核酸检测区域的选择极为关键。为了提高检测的敏感性，多数试剂厂家选择病毒核酸序列的两个或两个以上的区域进行检测，ORF1ab、N区和E区是常见的检测区域[6, 11,12]。在前期调研中，也发现实际检测中，存在一定比例单个靶区域阳性的结果，说明试剂对不同区域的敏感性可能存在差异，也可能是双靶标或三靶标之间的相互竞争作用所致。此外，试剂反应条件、反应体系优化、核酸加入量大小等都是可能影响检测分析敏感性的因素。由于试剂厂家研发时间短，试剂产品也没有使用已知临床标本进行必要的性能确认，可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间质量差异大等问题。通过从国家层面开展试剂的检测性能评价研究，探讨存在的问题，可以进一步改进试剂质量，提高分析敏感性。此外，临床核酸检测实验室在使用相应试剂产品前，可采用质控品对其精密度（重复性和再现性）和检测限等关键检测性能进行必要的性能验证；对于不同批次试剂间可能存在的质量差异，实验室可采用几份已知阴性和阳性的临床标本进行使用前的质检。
需要强调的是，试剂的分析敏感性是有极限的。目前2019-nCoV核酸检测试剂通常是在采集的标本（如1 ml）中取一部分（如140 μl）进行核酸提取，提取后再取所纯化的核酸溶液（如60 μl）中的一部分（如10 μl）进行扩增检测。因此，在临床标本中寻找病毒，就像在一本百万字的书里寻找错别字，理论上说，即使只有一个错别字也可以被发现；但实际上，由于成本、时间和寻找方式等的限制，只能从中随机抽取10万或者20万字进行查找，如果错别字数不够多，就有可能不在被抽取的字数当中，因此无法找到。同样，原始标本中病毒数量低于一定程度，就很可能在核酸扩增检测的反应体系中没有病毒核酸，试剂也就无法检出。因此，从这个层面上看，病毒核酸检测的假阴性是无法完全避免的。
标本运输保存条件（尤其是时间及温度）、临床实验室的规范操作（仪器设备的熟练使用及日常维护、标准操作程序的全员严格遵循、实验室的清洁等）、结果判读（可疑结果的复检策略尤为重要）和质量控制（阴性和弱阳性质控品在标本处理中及扩增时的摆放规则及失控后纠正和预防措施）等也是保证检测结果准确可靠的关键因素。通过加强对实验室人员的培训，不断完善实验室质量管理体系，可以减少因实验室检测操作层面出现的假阴性结果。
前面提到的4个环节中，任一个环节出现问题，都会导致已被感染的患者有些不能检出病毒核酸，从而与临床表现（如临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎）不符，因此这种假阴性无法完全避免。但是2019-nCoV特异性抗体检测，可以作为核酸检测有效的补充。抗体是机体感染病毒后，体液免疫应答的产物。检测特异抗体可以明确患者是否近期或既往感染过新型冠状病毒，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成。
在感染病毒过程中，不同患者在血液中出现特异IgM和IgG抗体的时间有差异，有研究对98例SARS感染患者在出现症状1~7 d、8~14d、15~21 d、22~28 d、29~60 d、61~90 d、91~180 d、181~720 d分别进行IgM/IgG检测，IgM/IgG的阳性率分别为0/0、39.4%/45.4%、71.4%/88.6%、88%/96%、48.6%/100%、30.9%/100%、17.1%/100%、0/100%，即在发病7d以后IgM和IgG才逐渐开始出现，IgM在发病3周后阳性率最高，在第30天左右滴度开始下降，第180天无法检出；大部分患者IgG到第15天出现阳性，并且滴度逐渐升高，第60天平均达到1∶670（1∶10为阳性），并持续到第180天仍维持此滴度水平[13]。Woo等[14]的研究表明，采用ELISA方法检测，20例SARS感染患者在12~33 d出现IgM（中位数为20.5 d），在2~39d出现IgG（中位数为17 d）。总的来说，国内外的临床研究表明，IgM多在发病第7天以后才有可能出现，30~60 d达到最高，60~180d完全消失；IgG也通常在发病第7天以后出现，60~120 d到达峰值，且高滴度可以保持到第180天甚至更长时间[15,16]。特异性抗体检测阳性不能像病毒核酸检测阳性一样，作为病毒感染的"金标准"，因为抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质（如类风湿因子、非特异IgM、自身抗体、溶血所致的高浓度血红蛋白等）的存在而出现假阳性结果。所以抗体检测必须采用IgM和IgG同时检测，且通常需多次动态检测来确认。
综上所述，临床医生所称的病毒核酸检测结果与临床表现不符的假阴性和临床实验室的病毒核酸检测假阴性都是存在的，通过采集不同部位标本、加强对标本采集人员的培训、提高核酸检测试剂的质量和实验室规范化检测，应可以最大程度减少实验室层面上的核酸检测假阴性。随着特异抗体检测试剂的研发及应用，特异IgM/IgG的联合动态多次检测，不但可以明显减少有病毒性肺炎临床症状和影像学证据、但核酸多次或始终检测为阴性的临床层面上的假阴性，而且绝大部分此类假阴性患者，如果加入特异IgM/IgG检测，最终应可以得到明确的诊断。
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