新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由2019新型冠状病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）感染引起的一种急性传染性疾病，基于实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法的病毒核酸检测是临床确诊的重要手段，但目前临床通过2019-nCoV的核酸检测结果确诊COVID-19存在阳性率偏低的现象。为明确这一问题出现的原因，本文在充分肯定核酸检测用于确诊COVID-19应用价值的基础上，从患者病程、标本采集、标本运输与保存、标本处理、核酸提取与扩增、病毒核酸变异等方面进行了分析，找出了影响核酸检测结果准确可靠的可能因素并提出了相应的建议。
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自2019新型冠状病毒肺炎（COVID-19）发生以来，感染病例快速上升，同时在医护人员的不懈努力之下，疫情得到了有效的控制。
基于实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法的病毒核酸检测是临床确诊的重要手段，但近期有媒体及专家反映新型冠状病毒核酸检测阳性率低，有的病例重复检测多次阴性后出现阳性结果，咽拭子标本多次检测阴性、但最后在呼吸道灌洗液标本中检测出阳性结果，电子计算机断层扫描（CT）影像筛查已出现COVID-19特征、但核酸检测呈阴性等问题。经过与临床分子诊断学专家、临床检验医学专家、临床呼吸病医学专家、临床影像医学专家交流，现对上述问题进行分析。
COVID-19是由2019新型冠状病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）感染引起的一种急性传染性疾病，而确定诊断的金标准就是能在患者体内找到2019-nCoV的存在。核酸检测就是检测2019-nCoV基因中某些特定核酸序列的存在，因此从方法学层面考虑其作为实验室诊断金标准没有任何疑问，而CT作为临床影像学筛查指标具有重要价值，但无论从早期诊断、鉴别诊断、排除诊断还是最终确诊等方面都还具有一定的局限性，更无法替代病原学诊断[1]。其实任何疾病本身都具有分层诊断的概念，在感染性疾病的诊断中，临床表现、流行病学史、影像学、病原学等指标都发挥重要作用，但病原学诊断肯定是最精准的诊断。当然我们在重视核酸检测在病毒感染诊断中的重要价值的同时，也要客观考虑由于其方法学特点、疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、核酸提取、扩增体系、人员操作等因素都可能造成最后检测结果的假阴性或假阳性。
目前，无论是临床实验室还是疾病预防控制中心（CDC）实验室，普遍应用的是实时荧光RT-PCR方法[2,3,4]，此检测方法成熟可靠，并已在常规检验和科研实验中被广泛应用[5]。该方法是将标本中的特定核酸序列进行扩增，理论上每一次扩增后的核酸数量都是成倍增加，经过40次以上扩增后，其核酸数量达到足够通过荧光等常规方法进行检测。如果质疑目前实验室所用2019-nCoV核酸检测方法的可靠性，可能是因为其对该方法原理和临床应用不甚了解。实时荧光RT-PCR方法从采集标本运送到实验室，再经过对标本的接收、处理（有时从安全考虑需要灭活处理，这点对于生物安全至关重要，但也有专家提出可能影响检测效率）、病毒核酸提取、核酸扩增、数据处理及报告，一般需要约4 h或更长时间。如何改进核酸提取和扩增流程，缩短整个检测时间是迫切需要解决的问题。目前也有一些厂家的检测试剂不是直接检测2019-nCoV核酸，而是病毒进入机体后机体产生的抗体（间接检测方法），病毒进入机体到机体产生特异性的抗体需要一段时间[6]，因此检测到病毒抗体肯定滞后于检测到病毒核酸。
因此不难理解病毒间接检测方法尽管有便捷、快速的优势，但与核酸检测比较有其应用的局限性，如何有效地将间接病毒抗体（抗原）检测方法与直接的病毒核酸检测方法联合应用，发挥其各自优势，急需要进行评价和验证。近期，也有一些专家推荐更灵敏的数字PCR方法、可以检测更多病毒基因位点的RT-PCR毛细管电泳方法、高通量检测的核酸质谱方法、更可靠的基因测序方法，但是这些先进的前沿检测技术存在3个问题：第一，时间太长，本来实时荧光RT-PCR的4~6 h大家都觉得长，其他方法有些要用10 h以上，甚至于24 h或更长时间；第二，实验室常规检验中大多数用的是实时荧光RT-PCR方法，如果换成新的方法，实验室还得重新购买设备、人员重新培训，成本太高；第三，检测过程相对复杂，对检测人员素质要求高，检测质量不易控制。以后如何对前沿检测技术进行简便易用的改良并在临床检测中广泛应用有必要成为关注重点。
大部分COVID-19患者的发病都会经历一个从感染后无症状到轻度症状出现，直至痊愈；少部分患者会发展到严重症状出现的过程[7]。不同病程、不同病情患者机体中的病毒存在量可能不同（已有病毒感染，但由于在相关部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以致于用现有方法检测不到）。因此，对临床高度疑似COVID-19患者，应该连续采集标本进行核酸检测[8]（这可能是临床患者多次检测阴性，阳性结果出现晚的主要原因之一）。其实任何病原学检测，都不能只根据1次阴性结果而做出排除性诊断，更不能根据核酸检测阴性而漏诊临床高度疑似的COVID-19患者，尤其在高发地区，在大面积流行期间。
很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本（这也是这两天被广泛评论的某患者咽拭子标本3次核酸检测阴性，收住院后在抢救过程中采集肺泡灌洗液标本核酸检测阳性的原因）。但下呼吸道的痰、肺泡灌洗液标本采集难度太大、易引起患者喷溅导致采集操作者感染风险增大，一般情况不建议使用（气管切开、呼吸机抢救患者可用）。近期发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版修正版）》[9]已将标本采集"咽拭子"更新为"鼻咽拭子"。为了提高检测阳性率，建议采集同一患者多部位标本，合并进行检测。例如，用口咽拭子、鼻咽拭子同时采集标本，然后放到同一采集管中送检。对于有消化道症状的疑似患者，可同时采集粪便或肛拭子进行检测。
采样的准确性存在操作者个人的依赖性，如果标本采集者操作不规范，也会导致采样误差。前期用于2019-nCoV核酸检测标本主要是口咽拭子，采集时让患者张大嘴后用特制棉签或小刷头刮取其咽部采集带病毒标本[4]。如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后检测结果阴性必然增加。
2019-nCoV为RNA病毒，很容易被来自于试剂、耗材等外源性或细胞破坏后所释放的内源性RNA酶降解[10]，而影响最后的检测效率。严格来讲标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。标本在常温条件下放置时间过长也可能是造成最后检测结果假阴性的原因[2]。虽然可以使用防病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果尚需要进一步评价。建议标本采集后及时送检，及时检测（4 h）。如因某些原因标本采集后不能及时送检或及时检测，应将其置于4℃保存（24 h）。24 h内不能检测的标本，建议于-70℃以下保存并避免反复冻融[8]。
前面已述及2019-nCoV核酸检测需要对所采集标本的核酸进行提取。目前，实验室较常用的提取标本核酸的方法为手工提取和核酸全自动提取仪提取。手工法实验过程由于人员等因素难以做到标准化；全自动核酸提取仪法在整个过程中需使用配套的核酸提取仪及相应的试剂，整个操作易于标准化。相比于手工法，核酸全自动提取仪可以避免一些手工操作容易出现的差错，对于检测结果影响较小[11,12]。而不同提取试剂和手工提取流程的掌控对最后提取到的核酸数量和质量可能存在差别，而从标本中所提取出的核酸数量和质量对于检测方法中下一个步骤的核酸扩增至关重要，从而直接影响最后的检测结果。
由于不同厂家试剂研发是根据2019-nCoV核酸OFR1ab、N、E等基因的特异性序列设计的扩增探针（不同厂家的扩增试剂可分为1个、2个或3个靶标基因位点检测试剂），而包含有不同靶标基因位点的试剂检测敏感度、特异度不同，试剂中酶、金属离子等成分与质量的差异，也都可能影响扩增效率和最后的检测结果[13]。
由于导致本次疫情的2019-nCoV是一种新型病毒，加之疫情突发性，试剂生产商只能根据有限公开的病毒核酸研究数据开展试剂研发，国家相关部门最早推荐了一些厂家的检测产品[4]，后来又审批了一些厂家检测试剂的注册申请。试剂生产厂家不同，核酸检测试剂盒的质量参差不齐，也会影响检测结果。目前开展2019-nCoV检测试剂研发生产的厂家已超过百家，正常情况下一个临床检测试剂产品从研发到应用需要通过一系列的临床验证与评估，但由于本次疫情的特殊性，时间的紧迫性，所研发试剂来不及完成常规流程，特别是无法得到一定数量临床患者标本的验证，有些厂家只能用2019-nCoV目标RNA序列通过噬菌体蛋白外壳包裹等方式模拟真实标本中的病毒进行验证。因此，对于临床某些高度疑似病例，或检测结果难以确定病例，建议用2种以上试剂进行检测、验证。
目前不同实验室用于2019-nCoV核酸检测的仪器（PCR仪或核酸扩增仪）种类有所不同，价格不等，不同的设备对检测过程中不同温度的控制精度、对荧光信号检测敏感度等不同，从而可能导致检测结果的差异[3,4]。
由于2019-nCoV为单股正链RNA病毒，其分子量大，具有易变异的特性[13]。随着疫情的延长，在人与人之间的传播过程中可能会产生基因位点核酸序列的变异。目前针对2019-nCoV研究还不够广泛、深入，病毒基因变异频率、突变热点都不清楚，如果变异的位点处于核酸扩增的引物结合区，就有可能出现假阴性结果。但目前有关病毒变异影响检测结果属于理论上的推理，尚无研究报道，且在试剂盒研发的过程中，针对多个核酸区域进行扩增也可有效避免核酸变异对检测结果的影响。
以上是对近期媒体及专家反映2019-nCoV核酸检测阳性率低可能原因的一些分析，由此可以理解，目前2019-nCoV核酸检测中各种原因引起的这样或那样的问题是现实存在的，也是难以避免的。我们不能因为这些问题的存在而普遍怀疑、甚至否定目前实验室2019-nCoV核酸检测结果。目前2019-nCoV核酸检测大多在三级医院或CDC二级以上实验室开展，这些实验室的管理水平、技术人员素质、检验设备的先进程度、检验过程的质量控制措施等方面普遍水平较高，而各实验室也在通过对工作的回顾总结或通过实验室之间的经验交流，不断改进、完善2019-nCoV核酸检测方法。
近期中华医学会检验医学分会也组织了相关方面专家对2019-nCoV核酸检测进行了探讨，并出台了2019-nCoV核酸检测相关专家共识[4]，同时一些新的基因检测平台也在不断研发。随着基因测序、数字PCR、RT-PCR毛细管电泳等技术的应用，2019-nCoV核酸检测中的问题一定会得到持续改进。
中华医学会检验医学分会及青年委员会各位专家对本文给予了修改建议
作者声明不存在利益冲突
