观察膝骨关节炎（OA）患者胫骨平台软骨组织中软骨细胞集落的形成及对膝OA发展的意义。
根据国际骨关节炎协会（OARSI）人关节软骨组织学等级评定系统获取0~1级、2~3级、4级三组软骨标本，制作组织学切片观察软骨细胞集落形成；免疫组化技术检测集落中软骨细胞Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、基质金属蛋白酶13（MMP-13）表达情况；获取0~1级、4级两组软骨标本，提取过渡层软骨细胞进行体外培养至第三代，观测24 h增殖率及细胞生长状态。两组间数据比较使用成组t检验。
OARSI等级0~1级组软骨组织浅表层完整、细胞数量多、过渡层软骨细胞无集落形成，2~3级组软骨组织浅表层破损、细胞数量明显减少、过渡层软骨细胞无集落形成，4级组软骨组织浅表层消失、过渡层出现明显软骨细胞集落；集落中软骨细胞Ⅱ型胶原表达减少，Ⅹ型胶原和MMP-13表达明显增多。体外培养0~1级组过渡层软骨细胞24 h增殖率较4级组低（8%±4%比16%±6%，t=3.722，P=0.002），细胞无明显集落样生长，而4级组软骨细胞呈集落样生长。
膝OA早期软骨组织浅表层存在时、过渡层软骨细胞增殖率低不形成集落；膝OA中期软骨组织浅表层缺失、过渡层软骨细胞增殖率增高并形成集落，集落中的软骨细胞呈现肥大化改变。
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膝骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种退变性疾病，是造成中老年人生活质量明显下降的重要致残因素[1]。膝关节的退变首先源于关节软骨组织的退变，而关节软骨组织的退变首先源于软骨细胞的退变[2]。关节软骨组织主要由软骨细胞和由其分泌的细胞外基质构成，故软骨细胞的生理状态决定了膝OA的发生发展。人膝软骨细胞在正常生理情况下接近稳定细胞，增殖能力低下；只有当软骨组织出现病理改变（如OA发生）时部分区域的软骨细胞才可能出现较高的增殖率[3]。病理情况下由软骨细胞增殖形成的细胞团在膝OA发展过程中的作用尚存争议[4,5,6,7,8]。根据细胞形态，软骨组织可分为浅表层、过渡层、放射层、钙化层[9]。我们在实验中发现，在OA发生发展过程中，软骨细胞集落主要在过渡层形成，且与浅表层的状态密切相关，现报道如下。
番红固绿试剂盒（美国Sigma公司）；兔抗人Ⅱ型胶原抗体（美国Abcam公司）；兔抗人Ⅹ型胶原抗体（美国Abcam公司）；兔抗人基质金属蛋白酶13（MMP-13）抗体（美国Abcam公司）；5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EDU）试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；DAPI试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗兔免疫组化、荧光二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；DMEM F12培养基（武汉博士德生物工程有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（武汉博士德生物工程有限公司）。石蜡捞片机、石蜡切片机、恒温展片机（德国Leica公司）；CO2恒温培养箱（北京白洋医疗器械有限公司）；Nikon E800显微镜（美国Nikon分公司）。
所有标本由山西省人民医院骨科提供，均得到标本捐献者的同意并签署知情同意书。OA组软骨组织来自膝OA置换手术中获取的标本（n=5），正常组软骨组织来自严重创伤性截肢标本（n=2）。该实验的实施得到了山西医科大学伦理委员会的批准[SXMUE（2019004）]。
取不同退变软骨标本制作组织学切片应用番红固绿染色后确定OARSI等级并分为3组：0~1级组、2~3级组、4级组，观察软骨细胞集落形成情况。
检测OARSI等级4级组软骨组织集落中软骨细胞内Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、MMP-13的表达情况并与0~1级组（正常软骨对照组）进行免疫组化评分比较：阳性染色强度0分为阴性染色，1分为弱阳性染色，2分为中等强度染色，3分为强阳性染色；阳性细胞比例0记为0分，阳性细胞比例>0~1%记为1分，阳性细胞比>1%~10%记为2分，阳性细胞比例>11%~30%记为3分，阳性细胞比例>31%~70%记为4分，阳性细胞比例>71%~100%记为5分，总评分=阳性细胞强度分+阳性细胞比例分。
根据组织学切片确定的OARSI等级0~1级组和4级组（本实验主要研究浅表层存在与否与过渡层软骨组织集落出现的关系，2~3级组软骨组织与0~1级组织为：浅表层、过渡层均存在，组织结构相似故不采用；5~6级软骨组织过渡层可能缺失，亦不采用）软骨组织标本，洁净操作台应用手术刀片刮除0~1级组软骨组织表层约0.5 mm、废弃、后削取约1 mm软骨组织，4级软骨组织直接削取1 mm软骨组织，将软骨组织放入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，使用眼科剪刀将软骨组织剪碎，体积<1 mm3，0.2%Ⅱ型胶原酶消化9 h、过滤后体外培养，待细胞贴壁率达到90%左右开始传代，传至第3代进行实验。
使用EDU技术检测软骨细胞24 h增殖率，大体定性观察两组软骨细胞生长状态：生长是否均匀、是否有集落形成。
应用SPSS 20.0软件进行数据的统计学分析。符合正态分布的计量资料采用
±s表示，两组间数据比较使用成组t检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。
0~1级组软骨组织表层完整、平坦，浅表层软骨细胞较小、呈横向排列，细胞数量较多，分布均匀；过渡层软骨细胞较大，细胞陷窝较明显，无明显细胞集落出现。2~3级组软骨组织表层破裂，细胞明显减少，过渡层软骨细胞分布均匀，没有明显细胞集落形成；4级组软骨组织浅表层消失，过渡层破损明显，呈现"毛刷样"外观，出现明显的细胞集落（图1）。
OARSI等级4级组软骨组织集落中的软骨细胞内Ⅱ型胶原表达低于0~1级组[（2.1±1.5）分比（6.6±2.7）分]，Ⅹ型胶原[（6.8±3.1）分比（1.4±0.6）分]和MMP-13[（7.4±2.3）分比（1.2±1.0）分]表达均明显增高（t=3.257、3.824、5.527，均P<0.05）（图2）。
软骨组织过渡层软骨细胞培养至第3代，0~1级组软骨组织来源的软骨细胞生长均匀，无明显细胞增殖集落形成，增殖率低于4级组软骨细胞（8%±4%比16%±6%，t=3.722，P=0.002）；4级组软骨组织来源的软骨细胞生长分布不均匀，增殖细胞呈明显的集落样外观，且增殖率高（图3）。
膝OA是一种严重危害中老年人健康的关节退行性疾病。研究发现关节软骨组织的退变源于软骨细胞的退变，故软骨细胞的生理状态决定着膝OA的发生与发展[11]。有学者发现，在膝OA的发展过程中，软骨组织中会出现软骨细胞的集落样生长[4,5,8,12]。有研究认为[7]集落的出现是机体代偿的反应性软骨细胞增生，用以弥补OA发展过程中软骨细胞数量的减少，其对OA的发展有一定的正性意义。但也有报道认为软骨组织中细胞集落的出现究竟是软骨组织自身的修复代偿还是进一步的破坏过程[12]，仍无法确定；同时发现纤维化生长因子2可以促使集落内软骨细胞的增殖。另有研究指出软骨组织集落中的软骨细胞体积和形态与细胞外基质的代谢密切相关，当细胞出现肥大化或纤维化表型时，分泌细胞外基质的能力就会下降，故该论文认为集落中的软骨细胞一般为异常增生软骨细胞[13]。同时也有研究认为关节软骨组织浅表层在OA发生发展过程中具有重要的作用，当浅表层形态出现异常时，OA就会快速进展[14]。但是目前仍没有发现对于软骨细胞集落形成的时间、出现的位置较为详细的报道。
OARSI人软骨组织等级评分系统0级和1级浅表层均完整、形态相似，2级和3级浅表层破裂、软骨组织裂伤可能到达过渡层、形态相似，4级浅表层缺失、软骨组织裂伤可能到达过渡层、放射层，5级和6级过渡层缺失可能是全层软骨组织缺失，我们在实验观察中发现软骨细胞集落形成与浅表层和过渡层有关，故我们选取了相应级别的标本组织进行观测。我们通过实验观察发现，软骨细胞集落主要出现在软骨组织的过渡层中，而极少出现在正常或残存的浅表层中；软骨组织放射层的上部偶尔也会出现软骨细胞的集落样外观，但出现几率较过渡层低。另外我们发现，过渡层出现软骨细胞集落的时机与浅表层的状态密切相关：当膝关节软骨组织浅表层完整时（OARSI等级0~1级），过渡层中很少出现软骨细胞集落；而当浅表层缺失时（OARSI等级4级），过渡层就会出现较多的集落。根据这一现象，我们假设：可能是考虑当OA发生的早期浅表层完整时，某种信号未能及时传递到过渡层来促进该区域的软骨细胞增殖，或者是某种机制抑制了该区域软骨细胞的增殖潜能；而当浅表层缺失后，过渡层软骨细胞才被"唤醒"其增殖潜能，进而以快速克隆增殖的方式来促进软骨细胞数量的增多。我们在研究过渡层软骨细胞集落生物学特性时发现：其克隆集落中的软骨细胞Ⅱ型胶原表达量非常低，说明这种快速增殖出的细胞表达软骨细胞特征性生物标志蛋白量较低，而这些细胞表达软骨细胞肥大化指标Ⅹ型胶原和MMP-13表达量却很高。这就说明这种快速克隆增殖出的软骨细胞迅速地出现了肥大化，而仅仅能分泌少量作为软骨组织基质重要成分的Ⅱ型胶原。随后，我们为了观察软骨组织过渡层细胞的增殖能力、选取了OARSI等级0~1级和4级软骨组织，提取相应过渡层软骨细胞进行体外培养，使用EDU技术检测细胞24 h增殖率（所有细胞核均可被DAPI染为蓝色，而子代细胞核同时也会被EDU染为红色）发现两组第三代细胞增殖能力和生长特点明显不同：0~1级组软骨细胞生长增殖均匀，无明显集落形成，且增殖率较低；而4级组软骨细胞增殖呈现集落样外观，增殖率明显提高。体外实验结果基本与组织学切片观察现象相符。
那么，为什么只有在OA发展到中期的病理条件下软骨组织中的软骨细胞才会出现快速的异常增殖，那么如何调控在OA早期即出现正常的软骨细胞增殖，这还有需要进一步的研究与探讨。
所有作者均声明不存在利益冲突
