探讨Wnt/β-连环链蛋白（catenin）/TCF-4通路在肾癌细胞中的作用，并初步分析其可能的机制。
分别构建β-catenin sh和TCF-4△Nsh的真核表达载体，并分别转染肾癌786-O细胞，采用CCK8检测转染后细胞的增殖能力，吖啶橙-溴乙锭（AO-EB）染色法检测转染后细胞死亡情况，Western印迹检测转染组、空转组以及空白组细胞TCF-4、Bcl-2、bax、Caspase-3的表达情况。
转染β-catenin siRNA病毒后，细胞的增殖能力较空转组明显降低（0.443±0.145与0.910±0.721），细胞死亡率较空转组明显增加（16.38±5.32与6.61±1.04），TCF-4的表达受抑制、凋亡蛋白Caspase 3、bax表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减低（均P<0.05）。转染TCF-4 siRNA病毒后，细胞的增殖能力较对照组明显降低，细胞死亡率较对照组明显增加，TCF-4的表达受抑制导致凋亡蛋白Caspase 3、bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减低（均P<0.05）。
Wnt/β-catenin/TCF-4通路在786-O肾癌细胞中具有可调节肾癌细胞的增殖和凋亡的作用，其机制可能为通过调节其下游的凋亡蛋白Caspase 3、bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平来实现。
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1982年Klaus等[1]首次在小鼠身上克隆得到Wnt基因，常见的Wnt信号通路有3种：Wnt经典途径（Wnt/β-catenin pathway）、Wnt-Ca2+信号通路和平面细胞极性途径（PCP）[2]，Wnt通路成分包括Wnt蛋白家族、β环连蛋白（β-catenin）、支架蛋白（axin/conductin）和T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）转录因子家族等[3]。Wnt/β-catenin通路可特异性结合细胞膜上的受体，并将信号传递给β-catenin，蓄积后的β-catenin可进一步发挥调控通路下游分子和下游靶基因的作用[4]。Wnt/β-catenin在多种肿瘤的发生发展中发挥调控作用，但Wnt/β-catenin/TCF-4在肾透明细胞癌中的研究较少。本研究以786-O作为实验细胞株，拟从多环节干预、多指标分析，探讨Wnt/β-catenin/TCF-4通路对肾癌细胞生物学行为的影响并探讨其作用机制。
β-catenin干扰慢病毒，购自Invitrogen公司，抗体：β-catenin（ab32572，Abcam），TCF4（ab217668，Abcam），半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3，ab197202，Abcam），Bcl-2（ab32124，Abcam），bax（ab32503，Abcam）。试剂盒：CCK8（HY-K0301，Med Chem Express），TUNEL（C1088，Beyotime）。
（1）β-catenin siRNA真核载体的构建；（2）病毒转染肾癌细胞；（3）β-catenin表达的检测；（4）TCF-4表达的检测；（5）Caspase-3、Bcl-2、bax等表达的检测；（6）细胞凋亡等生物学效应的检测。其中，β-catenin siRNA真核载体引物利用primer 6软件设计，由Invitrogen合成。
（1）构建稳转株；（2）TCF-4表达的检测；（3）Caspase-3、Bcl-2、bax等表达的检测；（4）细胞凋亡等生物学效应的检测。
（1）将处于对数生长期细胞（细胞培养瓶的细胞密度达80%左右）制备细胞悬液后进行细胞计数，将细胞密度调整为1×105个/ml，每组设4个复孔；（2）在保证每孔细胞密度基本一致的情况下，按上述分组以每孔100 μl单细胞悬液接种于96孔板；（3）接种上述设计的96孔板在5%CO2、37℃条件下的细胞孵育箱中继续培养；（4）48 h后终止孵育，加入100 μl新的完全培养基，同时每孔加入l0 μl的CCK-8溶液；（5）将培养板置于5% CO2、37 ℃条件下的细胞孵育箱中孵育2 h；（6）测量吸光度前2 000 r/min，5 min离心96孔板，去除加样孔中因加样产生的气泡，利用酶标仪测定450 nm的吸光度（A）值；（7）计算细胞增殖速度。
（1）用胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液处理细胞，处理完毕、离心并弃上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2~3次，除去死亡的细胞，培养基重悬细胞，计数并调整细胞密度达到1×106个/ml，将其接种于24孔板中，设定3组复孔，培养72 h；（2）配置AO/EB工作液：取试剂A、B、C，按照试剂A∶试剂B∶试剂C=1∶1∶8的比例稀释成AO/EB工作液，染色液配置环境要求在暗室中；（3）每一份细胞样品加入AO/EB液2 μl，将其混合均匀后低速离心并弃上清液；（4）用AO/EB Dilution缓冲液重悬细胞，将细胞密度调整为0.5~5×106个/ml；（5）加入1 μl AO/EB工作液，用1 ml移液器反复轻柔吹打，充分混匀；（6）取洁净载玻片，滴加5 μl细胞悬液，轻轻盖上盖玻片；（7）显微镜下观察细胞染色情况，吖啶橙嵌合到双链DNA分子中显绿色，与DNA单链或RNA结合时发橙红色荧光，溴化乙锭嵌合到双链DNA或RNA的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。吖啶橙可以透过活细胞膜，故活细胞呈绿色荧光，溴化乙锭不能通过与活细胞具有相同通透性的细胞膜，故死细胞呈橙色荧光。在显微镜下观察、拍照，每孔随机取3个视野技术，统计结果并分析。
数据以
±s表示，统计分析采用SPSS 13.0软件，各组样本均数之间的比较采用单因素方差分析，均数之间的两两比较采用Newman Keuls检验，检验水平（α）为0.05。
1．β-catenin对肾癌细胞Wnt/β-catenin/TCF-4通路、细胞增殖及凋亡的影响：β-catenin sh真核载体病毒转染786-O肾癌细胞，荧光检测其转染后的效率，结果显示可达90%以上（图1）。并RT-PCR检测肾癌细胞中β-catenin RNA的表达，结果显示：与对照组和阴性病毒组比较，实验组细胞中β-catenin RNA含量明显降低，P=0.003（图2）。
2．786-O肾癌细胞转染病毒后，CCK8检测β-catenin敲减细胞株的增殖能力。结果显示实验组细胞的增殖能力较空转组、对照组均明显降低，转染β-catenin siRNA病毒后，实验组肾癌细胞的增殖能力较空转组明显降低（0.443±0.145与0.910±0.721），P=0.016（图3）。
3．AO-EB染色法检测敲减β-catenin的786-O肾癌细胞死亡情况：结果显示敲减β-catenin的细胞株的死亡率较空转组明显升高[（31.33±3.21）与（6.60±1.51）]，P=0.007（图4）。
4．786-O肾癌细胞敲减β-catenin后，Western印迹检测显示各组细胞中Caspase 3、Bcl-2、bax蛋白的表达变化：结果显示，与对照组比较，实验组细胞的β-catenin、TCF-4的表达受抑制、凋亡蛋白Caspase 3、bax表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减低（图5）。
5．TCF-4对肾癌细胞Wnt/β-catenin/TCF-4通路、细胞增殖及凋亡的影响：TCF-4 siRNA真核病毒转染786-O肾癌细胞，荧光检测其转染后的效率，结果显示可达90%以上（图6）。RT-PCR检测肾癌细胞中TCF-4 RNA的表达，转染后肾癌细胞中TCF-4 RNA降低，TCF-4 sh细胞株构建成功（图7）。
6．786-O肾癌细胞转染TCF-4病毒后，CCK8检测转染成功后细胞株的增殖能力。结果显示实验组细胞的增殖能力（0.66±0.14）较空转组、（1.03±0.08）明显降低，P=0.024（图8）。
7．AO-EB染色法检测降低TCF-4后的786-O肾癌细胞死亡情况：结果显示TCF-4敲减细胞株的死亡率（16.38±5.32）较空转组（6.61±1.04）明显升高，P=0.037（图9）。
8．786-O肾癌细胞转染TCF-4 siRNA病毒后，Western印迹检测显示各组细胞中Caspase 3、Bcl-2、bax蛋白的表达变化情况。结果显示，与对照组比较，实验组细胞的TCF-4的表达受抑制、凋亡蛋白Caspase 3、bax表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减低（图10）。
Wnt通路和通路相关分子是靶向治疗肿瘤研究的热点[5]，也有多项研究证实Wnt/β-catenin参与多种肾脏疾病的病理过程，包括：多囊肾[6]、肾间质纤维化[7]、糖尿病肾病[8]、狼疮性肾炎[9]、IgA肾病[10]等。本研究通过慢病毒分别沉默β-catenin和TCF-4基因的表达，检测786-O细胞的增殖、凋亡，结果显示实验组细胞较对照组增殖率明显下降、凋亡增加。细胞在缺氧复氧处理过程中激活Wnt/β-catenin通路能显著增加凋亡蛋白Caspase 3、bax的活性，促进细胞凋亡[11]。为了观察Wnt/β-catenin/TCF-4通路对肾癌786-O细胞凋亡的影响，本研究应用AO-EB染色法及Western印迹观察β-catenin和TCF-4基因沉默后细胞凋亡的变化。Bcl-2是细胞凋亡重要的调控基因，本研究也检测了其表达水平的变化情况。
β-catenin是细胞质中一种重要的多功能蛋白，具有介导细胞黏附及参与Wnt信号传导的双重功能[12,13]。正常情况其定位于胞膜内侧，其作用在正常组织中呈被抑制状态。β-catenin作为Wnt信号通路重要的下游信号分子，胞质聚集到一定量后进入细胞核内并可以与TCF/LEF等转录因子结合，进而参与细胞增殖的调控[14]，故β-catenin作为Wnt信号通路的核心蛋白，其功能的激活与肿瘤发生发展密切相关[15,16]。
本研究成功构建了β-catenin以及TCF-4干扰病毒，应用其转染786-O细胞后，发现细胞增殖明显受到抑制，凋亡率明显增加，同时凋亡蛋白Caspase 3、bax表达增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表达减低。证实肾癌细胞中Wnt/β-catenin/TCF-4信号通路参与786-O细胞的增殖和凋亡活动，并一定程度上验证了其作用机制，为其在肾癌中的深入研究提供了一定的理论基础。
所有作者均声明不存在利益冲突
