探讨6%羟乙基淀粉130/0.4（HES）用于严重创伤骨科患者急性血液稀释后对蛋白的影响及发生机制。
选择2018年6至12月烟台市烟台山医院符合入选标准、择期行手术治疗的严重创伤骨科患者48例，随机数字表法分为两组（n=24）：乳酸钠林格组（A组）和HES组（B组）。A组患者气管插管后经静脉以0.5 ml·kg-1·min-1的速率输注10%血容量的乳酸钠林格液行急性血液稀释。B组患者气管插管后经静脉以0.5 ml·kg-1·min-1的速率输注10%血容量的HES行急性血液稀释。急性血液稀释前即刻（T0）、急性血液稀释后24 h（T1）、48 h（T2）测定总蛋白（TP）、血清白蛋白（HSA）、血浆循环内皮数量（CEC）、C反应蛋白（CRP）、血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-10、IL-6。HES输入人体后与HSA结合，荧光光谱法分析HES和HSA的结合关系，进一步研究HES对HSA的影响。
A组HSA、TP、CEC、TNF-ɑ、IL-6、IL-10、CRP在T0时分别为（38±5）g/L、（66±5）g/L、（5.5±0.4）个/0.9 μl、（24±5）μg/L、（8.9±0.8）μg/L、（44±6）μg/L、（13.6±1.4）mg/L；在T1时分别为（33±5）g/L、（60±6）g/L、（10.2±0.7）个/0.9 μl、（87±9）μg/L、（38.8±2.3）μg/L、（57±7）μg/L、（23.4±2.4）mg/L。B组HSA、TP、CEC、TNF-ɑ、IL-6、IL-10、CRP在T0时分别为（38±4）g/L、（66±5）g/L、（5.4±0.6）个/0.9 μl、（24±6）μg/L、（9.1±0.9）μg/L、（45±6）μg/L、（13.4±1.8）mg/L；在T1时分别为（35±5）g/L、（62±5）g/L、（7.4±0.6）个/0.9 μl、（70±8）μg/L、（29.5±3.1）μg/L、（72±6）μg/L、（19.7±2.2）mg/L。与T0时比较，A组HSA、TP在T1时降低（P<0.05）；与T0时比较，两组CEC在T1时升高（P<0.05）；与T0相比，两组TNF-α、IL-6、IL-10、CRP在T1和T2时升高（P<0.05）。与A组相比，B组CEC在T1时降低（P<0.05）；与A组相比，B组TNF-α、IL-6、CRP在T1和T2时降低（P<0.05）；IL-10在T1、T2时升高（P<0.05）。HES加入到HSA后，HSA的二级结构发生变化。随着HES浓度增加，HSA的荧光强度降低，HES诱发HSA荧光猝灭，HES与HSA的色氨酸（Trp）-214形成1∶1的结合物。
HES减少严重创伤骨科患者术后低蛋白的发生，HES输入体内后与HSA的Trp-214结合形成1∶1复合物，体积增大利于HES的机械堵漏，同时与保护血管内皮细胞和抗炎作用有关。
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患者严重骨科创伤及创伤伴随的手术治疗，常继发创伤性毛细血管渗漏[1]，表现为毛细血管内皮损伤，血管通透性增加，可出现低蛋白血症。低蛋白血症与感染、创伤应激等因素引起微血管蛋白渗漏密切有关[2]。白蛋白在维持机体的胶体渗透压、参与体内药物代谢等方面具有重要作用，目前临床中治疗低蛋白血症除补充蛋白外，方法有限。因此，围手术期给予药物干预减少严重创伤骨科患者蛋白的血管外渗漏具有重要的临床意义。6%羟乙基淀粉130/0.4（HES）的相对分子质量为130 000，分子量降低且更加集中，对凝血及肝肾功能的影响更小[3]。HES作为一种大分子物质可以治疗成人的毛细血管渗漏综合征，减少蛋白的血管外渗出，机制可能与其机械堵塞和抗炎作用相关[4]。本研究旨在评估HES对严重创伤骨科患者术后蛋白的影响及可能发生机制。
本研究为随机对照临床试验。已通过临床试验注册：国际临床试验伦理委员会（ChiCTR1800015469）。所有入组患者均签署知情同意书。选择2018年6至12月烟台市烟台山医院符合入选标准、择期行手术治疗的四肢或骨盆严重创伤骨科患者48例，性别、年龄不限，美国麻醉医师协会（ASA）分级：Ⅰ~Ⅲ级，随机数字表法分为两组（n=24）：乳酸钠林格组（A组）和HES组（B组）。参考美国机动车医学促进会2005版简明损伤计分法[5]，四肢或骨盆损伤3~4分为严重创伤骨科患者。排除复合伤患者及病情危及生命患者，患者无严重肺动脉高压、呼吸系统疾病，肝、肾功能未见异常，无HES过敏史。
患者入室后常规监测有创平均动脉压力（ABP）、心率（HR）、脉搏血氧饱和度（SpO2）和心电图（ECG）。麻醉诱导静脉注射咪达唑仑0.05 mg/kg、顺式阿曲库铵0.3 mg/kg、丙泊酚1.0~1.5 mg/kg和芬太尼3~5 μg/kg，气管插管术后连接呼吸机行机械通气。血浆靶控输注1~2 μg/ml丙泊酚和吸入1%~2%七氟烷维持麻醉。A组患者气管插管后以0.5 ml·kg-1·min-1静脉输注乳酸钠林格行急性血液稀释，输注量为血容量（VB）的10%。B组患者气管插管后以0.5 ml·kg-1·min-1静脉输注HES（批号：81LA161，德国Fresenius Kabi公司）行急性血液稀释，输注量为血容量的10%。血容量计算公式[6]：VB（L）=0.032 19×K+0.366 9×M3+0.604 1 （男）；VB（L）=0.033 08×K+0.356 1×M3+0.183 3（女）；K代表体重（kg），M代表身高（m）。
急性血液稀释前即刻（T0）、急性血液稀释后24 h（T1）、48 h（T2）测定总蛋白（TP）、血清白蛋白（HSA）、血浆循环内皮数量（CEC）、C反应蛋白（CRP），血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-2和IL-6。CEC的测定采用Percoll密度梯度离心法[7]，以密度1.05的Percoll液将内皮细胞分成上、中层，取各层悬液少许，置入细胞计数池，光学显微镜计数9大格，共4次计算平均值，所得数值为细胞数/0.9 μl，以因子Ⅷ相关抗原免疫荧光法鉴定CEC。
HES原液质量关系换算为4.62×10-4mol/L，取0.064 g HSA原液用磷酸盐缓冲溶液标定到pH 7.40，蒸馏水稀释到100 ml，得到1.0×10-4mol/L储备液。对于HSA-HES体系，利用JASCO J-810型圆二色谱仪在200~260 nm扫描范围内以扫描速度200 nm/min、扫描间隔0.2 nm进行测定。对于HSA，利用JASCO J-810型圆二色谱仪在190~260 nm扫描范围内、以0.2 nm为间隔进行测定。HSA浓度为2×10-7 mol/L，HES浓度为0、1×10−6、2×10−6 mol/L。HSA-HES混合体系中，HSA浓度为1×10−6 mol/L，HES浓度为0、1×10−6、2×10−6、3×10−6、5×10−6、7×10−6、10×10−6 mol/L，在278、298、318 K条件下，用F-4010荧光光谱仪在290~420 nm波长范围进行光谱扫描，记录HES对HSA的荧光猝灭光谱。
于3个10 ml比色管中加入HSA溶液以及一系列浓度的HES溶液，定容稀释到刻度。将样品室温下稳定30 min后，以荧光最大激发波长（λex）=荧光最大发射波长（λem）方式在200~600 nm波长范围内分别对样品利用荧光光谱仪进行同步扫描，测定时选择激发和发射狭缝均为5 nm，扫描速率为300 nm/min。HES-HSA体系中HES的浓度为0、3×10-4、6×10-4 mol/L。
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以
±s表示，组内不同时间点的参数比较采用重复测量数据方差分析，组间比较采用成组t检验。计数资料采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。双侧检验，检验水准α=0.05。
两组患者性别比例、体质指数（BMI）、术前患高血压及糖尿病比例、输液量和失血量比较，差异均无统计学意义（均P>0.05，表1）。
两组严重创伤骨科患者一般情况的比较（n=24）
两组严重创伤骨科患者一般情况的比较（n=24）
| 组别 | 性别（例，男/女） | 体质指数（kg/m2， ± s） | 高血压［例(%)］ | 糖尿病［例(%)］ | 输液量（ml/kg， ± s） | 失血量（ml， ± s） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| A组 | 15/9 | 24±4 | 7(29.2) | 4(16.7) | 7.7±0.6 | 361±66 |
| B组 | 14/10 | 24±4 | 6(25.0) | 4(16.7) | 7.7±0.5 | 357±54 |
| t/χ2值 | 0.087 | 0.000 | 0.106 | 0.000 | 0.063 | 0.230 |
| P值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 |
注：A组为乳酸钠林格组；B组为6%羟乙基淀粉130/0.4（HES）组
与T0比较，A组HSA、TP在T1时降低（P<0.05）；与T0比较，两组CEC在T1时升高（P<0.05）；与T0相比，两组TNF-α、IL-6、IL-10和CRP在T1、T2时升高（P<0.05）。与A组相比，B组CEC在T1时降低（P<0.05）；与A组相比，B组TNF-α、IL-6和CRP在T1、T2时降低（P<0.05），IL-10在T1、T2时升高（P<0.05）；两组间HSA、TP比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。结果见表2。
两组严重创伤骨科患者血蛋白及炎性因子和内皮数量的比较（n=24，
±s）
两组严重创伤骨科患者血蛋白及炎性因子和内皮数量的比较（n=24，±s）
| 组别 | HSA(g/L) | TP(g/L) | CEC（个/0.9 μl） | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| T0 | T1 | T2 | T0 | T1 | T2 | T0 | T1 | T2 | |
| A组 | 38±5 | 33±5a | 35±4 | 66±5 | 60±6 a | 61±5 | 5.5±0.4 | 10.2±0.7 a | 6.6±0.8 |
| B组 | 38±4 | 35±5 | 36±4 | 66±5 | 62±5 | 63±5 | 5.4±0.6 | 7.4±0.6 ab | 6.2±0.5 |
| 组别 | TNF-α(μg/L) | IL-6(μg/L) | IL-10(μg/L) | CRP(mg/L) | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| T0 | T1 | T2 | T0 | T1 | T2 | T0 | T1 | T2 | T0 | T1 | T2 | |
| A组 | 24±5 | 87±9a | 75±7a | 8.9±0.8 | 38.8±2.3a | 41.6±5.5a | 44±6 | 57±7 a | 56±6a | 13.6±1.4 | 23.4±2.4a | 20.2±2.4a |
| B组 | 24±6 | 70±8ab | 67±7ab | 9.1±0.9 | 29.5±3.1ab | 30.7±4.7ab | 45±6 | 72±6ab | 67±6ab | 13.4±1.8 | 19.7±2.2 ab | 17.9±2.0 ab |
注：HSA为白蛋白；TP为总蛋白；CEC为血浆循环内皮数量；TNF-α为肿瘤坏死因子α；IL-6为白细胞介素6；IL-10为白细胞介素10；CRP为C反应蛋白；T0为急性血液稀释前即刻；T1为急性血液稀释后24 h；T2为急性血液稀释后48 h；与T0时刻比较，aP<0.05；与A组比较，bP<0.05
图1显示了不同浓度HES存在时HSA的光谱。HSA在圆二色谱仪的紫外区208和222 nm处有两个负峰，这些是蛋白质α螺旋的特征峰。HSA的二级结构含量可以借助蛋白二级结构计算软件CDPro计算得到。当加入HES，HSA的α螺旋含量从57.4%减少到53.1%，β折叠从8.2%增加到11.7%，β转角从10.3%减少到9.6%，无规缠绕从24.1%增加到25.6%。
注：HSA∶HES为血清白蛋白与6%羟乙基淀粉130/0.4比值
随着HES浓度增加，HSA的荧光强度降低，HES诱发HSA荧光猝灭，表明HES与HSA发生结合作用，并且改变了HSA的空间结构；HSA的Trp-214结构蛋白参与了HES的相互作用；荧光光谱图见图2。结合位点数≈1，表明HES与HSA相互作用形成1∶1的结合物（表3）。
不同温度下HSA与HES的猝灭常数和结合参数
不同温度下HSA与HES的猝灭常数和结合参数
| 温度(K) | 猝灭常数 | 结合参数 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Kq | Ksv | r | Ka | n | r | |
| 278 | 1.07×1013 | 1.07×105 | 0.998 9 | 2.99×105 | 1.09 | 0.997 6 |
| 298 | 8.07×1012 | 8.07×102 | 0.999 5 | 1.20×105 | 1.03 | 0.999 4 |
| 318 | 6.18×1012 | 6.18×102 | 0.999 6 | 1.24×105 | 1.06 | 0.999 2 |
注：HAS为血清白蛋白；HES为6%羟乙基淀粉130/0.4；Kq为猝灭速率常数；Ksv为Stern-Volmer猝灭常数；Ka为结合常数；n为结合位点数；r为相关系数
不同浓度HES存在时HSA的共振光散射光谱见图3。体系的最大散射峰出现在290 nm左右，此时光散射信号强且稳定。在加入了HES、pH=7.4条件下，HSA共振光散射强度有明显提升，继续加入大量HES后，光散射信号强度无显著提高。
注：1~3各条曲线分别代表HES浓度为0、3×10-4、6×10-4 mol/L
HSA参与体内几乎所有物质的存储、转运、分解和代谢。HSA是由19种氨基酸和1种亚氨基酸组成的多聚体，相对分子质量为66 000，HSA多肽链上含有多个二硫桥，一个色氨酸残基（Trp214）和一个半胱氨酸残基（Cys34）。二硫键和氢键是构建人血清白蛋白分子二维、三维结构的重要力量。圆二色谱是一种可以灵敏检测蛋白质二级结构的技术，本研究结果显示α螺旋含量降低，这表明HES影响了HSA骨架链上的氨基酸残基，破坏了氢键网络，引起了蛋白质结构的部分展开和空间结构改变。
荧光光谱法[8]根据HSA与HES作用前后的荧光光谱的变化，确定两者之间的结合关系。本研究结果显示，随着HES浓度增加，HSA的荧光强度降低，HES诱发HSA荧光猝灭，表明HES与HSA发生结合作用并且改变了HSA的空间结构。荧光猝灭技术是利用某些物质的荧光在特定条件下会下降的物理现象[8]，HES本身没有荧光性，与HSA相互作用后引起HSA的荧光猝灭。假设为动态猝灭，为验证这种假设，引入了著名的Stern-Volmer公式[9]：
F0和F代表猝灭剂不存在和存在时的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度，τ0为猝灭剂不存在时的荧光寿命，Kq为生物大分子的猝灭速率常数，Ksv代表Stern-Volmer猝灭常数。本研究结果表明，随着温度升高，Ksv值下降，经计算不同猝灭剂条件下的动态猝灭速率常数Kq的最大值为2.0×1010。表3中HSA-HES体系中所得到的Kq值远>2.0×1010，因此动态猝灭假设不成立，表明HSA和HES结合物为静态猝灭。通过计算可以得到作用过程的结合常数（Ka）和结合位点数（n）。为此本研究引入下面的公式[9]：
F0和F代表猝灭剂不存在和存在时的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度，Ka代表结合常数，n代表结合位点数。经计算，结合位点数≈1，表明HES与HSA相互作用时只有一个结合位点，结合图2B，表明HES与HSA的Trp-214形成1∶1的复合物。以往研究表明[4]，HES具有减少毛细血管渗漏与机械堵漏和抗炎作用有关。本研究深化了机械堵漏的作用机制，HES与HSA的Trp-214形成1∶1复合物，体积增大，所以利于机械堵漏，是减少患者术后低蛋白血症发生的机制。
本研究使用共振光散射光谱监测HES与HSA结合后尺寸的变化。当固定浓度的HSA被不同浓度的HES滴定后，其共振光信号明显增强，根据共振光散射光相关理论，共振光信号与被测物的尺寸直接相关。Pasternack和Collings[10]提出，当大分子团聚形成复合物的尺寸越大，共振光信号越强，因此可以推断，HSA与HES形成复合物之后，复合物之间发生了团聚，形成更大的个体，并且这些个体都比HSA分子大。这些团聚体有利于血管的机械堵漏。继续加入HES后，混合溶液信号不再增强，证明过量HES不会进一步引起团聚，这也从侧面证明了HES的安全性。
手术创伤的伤害性刺激启动炎性反应及细胞因子的释放，其中主要有促炎因子IL-6、TNF-α和抗炎因子IL-10。TNF-α是机体受到伤害性刺激后最初分泌和起关键性始动作用的因子，可刺激IL-6的产生，IL-6是典型的促炎细胞因子和手术后组织损伤的标志。IL-10是内源性抗炎介质[11]，由促炎因子和内毒素诱导产生，抑制多种炎症细胞的分泌功能和炎性因子的生成，通过调节TNF-α、IL-6的产生减轻炎症反应。最新动物研究表明[12]，HES在小鼠全身和肺部炎症期间降低血管通透性，并减弱全身炎症期间血管通透性的增加，从而治疗毛细血管渗漏。本研究发现，B组患者炎性因子IL-6、TNF-α低于A组，抗炎因子IL-10高于A组，HES能减少患者的炎性反应。CEC是目前活体内唯一能特异和直接提示反映血管内皮细胞损伤的指标，其数量和形态的改变，可反映血管内皮细胞的损伤程度[13]，因子Ⅷ相关抗原免疫荧光法是鉴定CEC最可靠的方法[7]。本研究结果表明，B组CEC在术后24 h明显小于A组，表明HES可以减少血管的损伤程度，对血管内皮具有保护作用，减少蛋白的渗漏。
综上所述，术前输入HES可以减少严重创伤骨科患者低蛋白的发生率，其机制可能与HES保护血管内皮、抑制炎性反应和机械堵漏有关。本研究主要使用荧光光谱法分析HES与HSA的相互作用，圆二色谱研究发现HES引起HSA的蛋白二级结构发生变化，荧光光谱仪发现HES与HSA的Trp-214形成1∶1复合物、体积增大所以利于机械堵漏，共振光散射分析得到HSA加入HES后体积明显增大，此是机械堵漏的具体作用机制。由于光谱仪分析只能反映大小、形态的变化趋势，不能测量出HES与HSA直径变化后准确的数值，这是本研究的不足之处。
所有作者均声明不存在利益冲突
