菅朝慧; 赵爱华; 马晓静; 陆蔚; 朱玮; 王煜非; 周健; 包玉倩

doi:10.3760/cma.j.cn112137-20200312-00726

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• 临床研究 •

唾液1,5-脱水葡萄糖醇不同检测方法的一致性

中华医学杂志, 2020,100(42) : 3291-3295. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20200312-00726

摘要

目的

在不同糖代谢人群中评估唾液1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）不同检测方法的一致性。

方法

2018年1月至2019年6月于上海交通大学附属第六人民医院招募175名正常糖代谢（NGT）的健康志愿者（21~65岁，男58名，女117名）和80例糖尿病患者（18~70岁，男44例，女36例），使用唾液采集管收集唾液，采用酶法及质谱法同时检测唾液1,5-AG水平，采用酶法测定血清1,5-AG水平。

结果

在NGT人群中，酶法检测的血清及唾液1,5-AG水平均与液相色谱质谱（LC-MS）检测的唾液1,5-AG水平呈正相关（r=0.247、0.523，均P<0.05），但酶法检测的唾液及血清1,5-AG水平之间无明显相关性（r=-0.074，P=0.333）。在糖尿病患者中，酶法检测的血清及唾液1,5-AG水平均与气相色谱质谱（GC-MS）检测的唾液1,5-AG水平呈正相关（r=0.284、0.423，均P<0.05），但酶法检测的唾液及血清1,5-AG水平之间无明显相关性（r=-0.079，P=0.487）。

结论

酶法检测的血清及唾液1,5-AG水平均与质谱法检测的唾液1,5-AG水平有良好的一致性。由于酶法检测唾液与血清1,5-AG水平相关性欠佳，唾液1,5-AG酶法检测的临床推广尚需进一步改进。

引用本文: 菅朝慧, 赵爱华, 马晓静, 等. 唾液1,5-脱水葡萄糖醇不同检测方法的一致性 [J] . 中华医学杂志, 2020, 100(42) : 3291-3295. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20200312-00726.

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1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-anhydroglucitol，1,5-AG）可反映过去7~10 d的平均血糖水平，其在反映血糖波动和餐后高血糖方面较传统血糖监测指标更具优势^[1]。最初血清1,5-AG均采用质谱法检测，但需对样本进行除蛋白预处理，费时、昂贵，不适合临床广泛应用，因此1991和2003年分别出现日本的Lana^®1,5-AG酶法试剂盒和美国的Glycomark^TM试剂盒^[2]。既往多项研究对血清1,5-AG的酶法和质谱法检测进行了比较和评估^[3]。近年来已有多项以唾液为生物样本进行的糖尿病临床研究，但国内外关于唾液1,5-AG的研究却少见。本研究旨在在不同糖代谢人群中评估唾液1,5-AG不同检测方法及唾液与血清1,5-AG水平的一致性，为唾液1,5-AG的临床应用提供理论依据。

对象与方法

一、研究对象

2018年1月至2019年6月于上海交通大学附属第六人民医院招募正常糖代谢（NGT）健康志愿者和糖尿病患者。纳入标准：（1）18~70岁；（2）糖代谢正常，或1型/2型糖尿病。排除标准：（1）存在影响体内1,5-AG水平的因素，如胃大部切除术后、囊性纤维化、服用远志或美远志等中药；（2）严重肝、肾功能异常。本研究经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准（批件号：2017-051），所有研究对象均签署知情同意书。

二、研究方法

1．样本采集及生化检测：

测量所有研究对象的身高、体重和血压，计算体质指数（BMI），BMI=体重（kg）/身高²（m²）。采血测定空腹血糖（FPG）、糖负荷后2 h血糖（2 h PG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、糖化白蛋白（GA）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。使用Salivette唾液采集管（德国莎斯特公司）收集唾液样本。唾液采集方法与注意事项及实验室检测方法均参照本课题组既往研究^[4]。

2．唾液及血清1,5-AG水平的检测：

1,5-AG酶法测定使用Glycomark^TM试剂盒（美国Glycomark公司）。1,5-AG的酶法测定主要包括两个步骤。第一步，通过葡萄糖激酶排除葡萄糖对吡喃糖氧化酶（PROD）的干扰。第二步，PROD氧化1,5-AG的2号碳上的羟基。上述过程均在日立7600-120全自动生化分析仪（日本日立公司）中完成。采用液相色谱质谱联用（LC-MS）检测NGT者唾液1,5-AG水平（沃特世Xevo TQ，美国沃特世公司），气相色谱质谱联用（GC-MS）检测糖尿病患者唾液1,5-AG水平（安捷伦7890B，美国安捷伦公司）。

3．诊断标准：

糖代谢状态的判断根据1999年世界卫生组织标准^[5]，NGT为FPG<6.1 mmol/L且2 h PG<7.8 mmol/L；糖尿病为FPG≥7.0 mmol/L和（或）2 h PG≥11.1 mmol/L。

三、统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布连续型变量以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态数据以M（Q₁，Q₃）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。采用Spearman相关分析唾液及血清1,5-AG的关系。采用Bland-Altman散点图分析不同方法检测唾液1,5-AG的一致性，Bland-Altman法以图形方式反映定量资料的一致性，用两种方法测定结果差值的均数估计偏倚，差值的标准差描述变异情况。差值的95%CI即为一致性界限，若两种测量结果的差异位于一致性界限内则两种方法有较好的一致性。均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、NGT健康志愿者中1,5-AG水平的一致性分析

1．NGT者的临床特征：

共纳入NGT者175名（男58名，女117名），年龄24（23，27）岁，范围21~65岁，FPG为（4.9±0.4）mmol/L，HbA1c为5.4%（5.2%，5.4%），血清1,5-AG为（21.6±6.5）mg/L，酶法唾液1,5-AG为3.3（2.3，4.3）mg/L，LC-MS唾液1,5-AG为（0.59±0.34）mg/L。男性的BMI、收缩压、舒张压、TG、FPG、血清1,5-AG均高于女性（均P<0.05），HDL-C和GA均低于女性（均P<0.05）。年龄、TC、LDL-C、2 h PG、HbA1c、酶法唾液1,5-AG和LC-MS唾液1,5-AG在不同性别间差异均无统计学意义（均P>0.05，表1）。

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表1

不同性别正常糖代谢健康志愿者临床特征比较

表1

不同性别正常糖代谢健康志愿者临床特征比较

项目	男性（n=58）	女性（n=117）	t/Z值	P值
年龄（岁）^a	24(23，28)	24(23，27)	-0.101	0.919
BMI（kg/m²）^b	21.9±1.6	21.3±1.7	2.161	0.032
收缩压（mmHg）^b	121±10	111±10	6.200	<0.001
舒张压（mmHg）^b	74±6	70±7	3.153	0.002
TC（mmol/L）^a	4.4(4.0，5.1)	4.5(4.0，5.2)	-0.276	0.783
TG（mmol/L）^a	0.7(0.6，1.0)	0.7(0.4，0.8)	-3.081	0.002
HDL-C（mmol/L）	1.4±0.2	1.7±0.3	-5.794	<0.001
LDL-C（mmol/L）^a	2.6(2.2，3.2)	2.4(2.0，2.9)	-1.400	0.162
FPG（mmol/L）^b	5.04±0.34	4.83±0.35	3.752	<0.001
2 h PG（mmol/L）^b	5.49±0.86	5.32±0.98	1.164	0.246
HbA1c（%）^a	5.4(5.3，5.4)	5.4(5.2，5.4)	-0.935	0.350
GA（%）^b	13.2±1.1	13.6±1.2	-2.099	0.037
血清1,5-AG（mg/L）^b	26.0±6.7	19.4±5.3	7.065	<0.001
酶法唾液1,5-AG（mg/L）^a	3.2(2.2，4.3)	3.3(2.6，4.4)	-1.094	0.274
LC-MS唾液1,5-AG（mg/L）^b	0.61±0.33	0.58±0.34	0.548	0.585

注：BMI为体质指数；TC为总胆固醇；TG为三酰甘油；HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇；FPG为空腹血糖；2 h PG为糖负荷后2 h血糖；HbA1c为糖化血红蛋白；GA为糖化白蛋白；1,5-AG为1,5-脱水葡萄糖醇；LC-MS为液相色谱质谱；^aM（Q₁，Q₃）；^b±s；1 mmHg=0.133 kPa

2．NGT中唾液及血清1,5-AG水平的一致性分析：

Spearman相关分析结果显示，血清1,5-AG与LC-MS检测的唾液1,5-AG呈正相关（r=0.247，P=0.001，图1A）。酶法检测唾液1,5-AG与LC-MS检测的结果亦呈正相关（r=0.523，P<0.001，图1B）。采用Bland-Altman散点图进行一致性分析，结果显示酶法唾液1,5-AG与LC-MS唾液1,5-AG平均差值及其95%CI为3.0（-0.2~6.1）mg/L，落在平均差值±1.96 s线内的百分数为94.9%（图2）。然而酶法测定的唾液1,5-AG与血清1,5-AG无明显相关性（r=-0.074，P=0.333，图1C）。

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图1

正常糖代谢健康志愿者中血清和唾液1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平的相关性　A：液相色谱质谱（LC-MS）法测得唾液1,5-AG与酶法血清1,5-AG相关性；B：LC-MS法测得唾液1,5-AG与酶法唾液1,5-AG相关性；C：酶法血清1,5-AG与酶法唾液1,5-AG相关性

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图1

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图2

正常糖代谢健康志愿者中唾液酶法和液相色谱质谱（LC-MS）检测1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平的一致性

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图2

正常糖代谢健康志愿者中唾液酶法和液相色谱质谱（LC-MS）检测1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平的一致性

二、糖尿病患者中1,5-AG水平的一致性分析

1．糖尿病患者的临床特征：

本研究共纳入糖尿病患者80例（男44例，女36例），其中1型糖尿病10例，2型糖尿病70例，年龄18~70岁，中位数59.5（51.0，64.0）岁，FPG为6.81（5.47，8.27）mmol/L，HbA1c为（8.2±1.6）%，血清1,5-AG为3.2（1.4，7.1）mg/L，酶法唾液1,5-AG为（5.0±2.8）mg/L，GC-MS唾液1,5-AG为（0.95±0.18）mg/L。女性的TC、TG、FPG及酶法唾液1,5-AG均高于男性（均P<0.05）。年龄、BMI、收缩压、舒张压、HDL-C、LDL-C、2 h PG、HbA1c、GA、血清1,5-AG和GC-MS唾液1,5-AG水平在不同性别间差异均无统计学意义（均P>0.05，表2）。

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表2

不同性别糖尿病患者临床特征比较

表2

不同性别糖尿病患者临床特征比较

项目	男性（n=44）	女性（n=36）	t/Z值	P值
年龄（岁）^a	59(51，65)	61(52，64)	-0.063	0.950
BMI（kg/m²）^b	25.1±2.8	24.4±2.8	1.221	0.226
收缩压（mmHg）^b	128±11	127±17	0.422	0.674
舒张压（mmHg）^b	79±9	77±9	1.067	0.289
TC（mmol/L）^b	4.3±1.1	5.0±1.2	-2.840	0.006
TG（mmol/L）^b	1.3±0.8	1.8±1.1	-2.411	0.018
HDL-C（mmol/L）^b	1.2±0.4	1.2±0.3	0.073	0.942
LDL-C（mmol/L）^b	2.6±0.8	3.0±1.0	-1.903	0.061
FPG（mmol/L）^a	6.2(5.3，7.6)	7.0(6.2，9.8)	-1.983	0.047
2 h PG（mmol/L）^b	12.2±4.4	13.4±4.7	-1.149	0.254
HbA1c（%）^b	8.1±1.6	8.4±1.5	-0.805	0.423
GA（%）^b	20.3±4.7	21.4±5.3	-0.980	0.330
血清1,5-AG（mg/L）^a	3.3(1.6，7.4)	2.7(1.3，5.5)	-0.595	0.552
酶法唾液1,5-AG（mg/L）^b	4.4±2.5	5.7±2.9	-2.191	0.031
GC-MS唾液1,5-AG（mg/L）^b	0.94±0.18	0.95±0.18	-0.339	0.736

注：BMI为体质指数；TC为总胆固醇；TG为三酰甘油；HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇；FPG为空腹血糖；2 h PG为糖负荷后2 h血糖；HbA1c为糖化血红蛋白；GA为糖化白蛋白；1,5-AG为1,5-脱水葡萄糖醇；GC-MS为气相色谱质谱；^aM（Q₁，Q₃）；^b±s；1 mmHg=0.133 kPa

2．糖尿病患者唾液及血清1,5-AG水平的一致性分析：

Spearman相关分析结果显示，血清1,5-AG与GC-MS检测的唾液1,5-AG呈正相关（r=0.284，P=0.011，图3A）。酶法检测唾液1,5-AG与GC-MS检测的结果亦呈正相关（r=0.423，P<0.001，图3B）。采用Bland-Altman散点图进行一致性分析，结果显示酶法唾液1,5-AG与GC-MS唾液1,5-AG平均差值及95%CI为4.0（-1.3~9.4）mg/L，落在平均差值±1.96 s线内的百分数为97.5%（图4）。然而酶法测定的唾液1,5-AG与血清1,5-AG无明显相关性（r=-0.079，P=0.487，图3C）。

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图3

糖尿病患者血清和唾液1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平的相关性分析　A：气相色谱质谱（GC-MS）法测得唾液1,5-AG与酶法血清1,5-AG相关性；B：GC-MS法测得唾液1,5-AG与酶法唾液1,5-AG相关性；C：酶法血清1,5-AG与酶法唾液1,5-AG相关性

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图3

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图4

糖尿病患者唾液酶法和气相色谱质谱（GC-MS）检测1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平的一致性

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图4

糖尿病患者唾液酶法和气相色谱质谱（GC-MS）检测1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平的一致性

讨论

血糖监测是糖尿病管理的核心内容，围绕血糖监测开展的研究已拓展至很多方面^[6,7]。血清1,5-AG作为较新的短期血糖监测的糖代谢标志物已被写入2015年《中国血糖监测临床应用指南》^[8]。除反映短期血糖控制水平和血糖波动，亦有研究报道了血清1,5-AG在预测糖尿病一级亲属的早期葡萄糖代谢异常^[9]、反映早期相胰岛素分泌功能^[10]、糖尿病筛查^[11]及糖尿病并发症^[12]等方面的应用。

质谱技术是测定唾液1,5-AG水平的精确方法。Mook-Kanamori等^[13]利用超高效液气相-串联质谱联用检测188例2型糖尿病患者和181例NGT者唾液及血清1,5-AG水平，发现糖尿病患者唾液和血清1,5-AG显著低于NGT人群，唾液1,5-AG与血清1,5-AG呈显著正相关，与血糖及HbA1c呈显著负相关。该研究证实了唾液1,5-AG这一无创指标在糖尿病中的可用性。Halama等^[14]采用Glycomark^TM试剂盒对上述研究冻存2年的82份唾液样本进行了检测，结果显示酶法血清1,5-AG检测值与质谱法血清1,5-AG检测结果呈显著正相关（r²=0.902），但酶法唾液1,5-AG检测值与质谱唾液1,5-AG检测结果相关性很弱（r²=0.047）。此外亦有关于唾液1,5-AG与儿童龋齿风险的研究，采用酶联免疫吸附测定试剂盒检测唾液1,5-AG，但该研究并未检测血清1,5-AG，因此无唾液与血清1,5-AG一致性的比较^[15]。

与Halama等^[14]报道的结果不同，本研究发现唾液1,5-AG的酶法检测值与质谱法检测结果呈正相关。究其原因，可能是由于本研究样本量较大，检测样本均为新近采集，未经长时间冷冻。此外，本研究首次对酶法检测的唾液与血清1,5-AG的一致性进行了分析，发现二者的相关性欠佳，为在已有试剂盒的基础上进一步开发适用于唾液1,5-AG检测的便捷方法提供了依据。

在血浆中，只有葡萄糖可能会干扰1,5-AG酶法试剂盒检测结果，其他单糖的含量均非常低^[14]。而Mook-Kanamori等^[13]对唾液成分的代谢分析显示唾液中除葡萄糖外，还含有半乳糖、岩藻糖、木糖和甘露糖，它们均可充当PROD底物，干扰测定读数。因此唾液与血清单糖成分的差异提示目前针对血清1,5-AG检测的商用试剂盒用于唾液1,5-AG的检测可能尚需进一步改善。

本研究存在一定的局限性。本研究采用了不同的色谱方法检测NGT健康志愿者和糖尿病患者的唾液1,5-AG，可能导致了检测结果绝对值存在差异，同一种质谱方法下两组研究对象的唾液1,5-AG水平的比较有待验证。由于成本问题，本研究未同时用质谱法检测唾液及血清1,5-AG水平，因此质谱方法下不同基质中1,5-AG水平的一致性尚需进一步验证。

综上所述，本研究发现，无论在NGT或糖尿病人群中，以质谱法为参照，酶法检测的血清及唾液1,5-AG水平均与之具有良好的一致性，但酶法检测唾液1,5-AG水平与血清1,5-AG水平相关性欠佳，因此唾液1,5-AG酶法检测的临床推广尚需进一步改进。

临床试验注册：

中国临床试验注册中心，ChiCTR-SOC-17011356

Trial Registration:

Chinese Clinical Trial Registry, ChiCTR-SOC-17011356

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

菅朝慧