我国结直肠癌的发病率和死亡率逐年升高，目前缺乏有效无创、依从性高的结直肠癌筛查方法。粪便DNA和RNA检测是近年新兴的非侵入性结直肠癌筛查手段，尤其是粪便多靶点DNA和微小RNA（miRNA）检测具有无创无痛、敏感性高、安全方便等特点，能在很大程度上弥补传统筛查方法的不足。国外已将粪便多靶点DNA检测纳入结直肠癌的筛查指南，但其也存在特异性低、价格昂贵、癌前病变检出率低等不足。粪便miRNA检测具有敏感性和特异性较高（miR-451）、癌前病变检出率高（miR-92a）等优势，但缺乏大样本、多中心的循证医学证据支持。本文对粪便标志物DNA和RNA筛查结直肠癌进展进行综述，重点介绍粪便多靶点DNA和miRNA检测的特性。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
结直肠癌的发病率和死亡率位列我国恶性肿瘤的第5位且有逐年升高的趋势[1]，但在美国为代表的西方国家，结直肠癌发病率逐年降低，总体死亡率也持续下降。据统计，经规范治疗的确诊结直肠癌患者5年生存率接近64%[2]。分析发现，结直肠癌早诊筛查的开展是其发病率降低的主要原因。结直肠癌传统的早诊筛查手段主要包括愈创木脂法粪便潜血试验（gFOBT）、粪便免疫化学检测（FIT）、结肠镜等[3]。gFOBT虽然操作简便，但敏感性和特异性都较差，且测试前有严格的饮食控制。FIT筛查晚期腺瘤的敏感性较低。结肠镜检查是目前结直肠癌诊断的金标准，能有效检出结直肠癌和恶性腺瘤性息肉，但也存在费用高昂、具有侵入性和并发症风险等不足。此外，结肠镜检查对右半结肠病变的检出率低[4]。粪便DNA、RNA检测作为一种新兴的非侵入性筛查方法，具有较高的敏感性和特异性，在结直肠癌的筛查中具有广阔应用前景。本文将对粪便DNA和RNA检测筛查结直肠癌的特性进行综述。
结直肠癌的发生是正常肠上皮-非进展期腺瘤-进展期腺瘤-腺癌最终发展到癌转移的一系列复杂演变过程，伴随大量癌基因和抑癌基因的突变，包括APC、K-ras、p53、结直肠癌缺失基因（DCC）、微卫星不稳定标志物BAT26、DNA异常甲基化等。结直肠黏膜表面细胞不断脱落到肠腔，脱落的肿瘤细胞比正常结直肠黏膜上皮细胞有生存优势。结直肠癌患者黏膜细胞脱落到肠腔的比例高于正常人,因此，通过检测粪便样本里从肠道脱落的肿瘤细胞中的DNA突变情况、DNA异常甲基化水平及潜隐血红蛋白含量，进而统计分析便可初步判断受试者是否患有结直肠癌。目前粪便DNA检测筛查结直肠癌的方法包括单靶点、DNA甲基化和多靶点检测。
Sidransky等[5]于1992年首次发现结直肠癌患者粪便中存在K-ras的突变基因，这一发现开启了粪便DNA检测筛查结直肠癌的研究。随后相继出现包括P53、APC、DCC、BAT26等基因突变的粪便检测，但其检测敏感性都较低，导致粪便单靶点DNA检测筛查结直肠癌无法推广。
结直肠癌的发生与表观遗传学因素有着密切的关系，包括DNA甲基化异常、非编码RNA（如miRNA）失调和组蛋白修饰状态的改变。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNMT）作用下，将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的胞嘧啶中5′碳原子上形成mCpG。抑癌基因启动子区域CpG岛异常高甲基化是许多肿瘤发生的早期事件。1985年，Goelz等在结直肠癌组织中首次发现DNA去甲基化异常后，关于结直肠癌DNA甲基化的研究陆续被报道。研究发现，联合分泌型卷曲相关蛋白2（SFRP2）与Wnt受体卷曲蛋白结合可抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导，当SFRP2基因启动子甲基化后Wnt信号通路被激活，促进肿瘤发生。2004年，Müllier等[6]发现粪便SFRP2甲基化检测筛查结直肠癌的敏感性为77%~90%，特异性为77%。波形蛋白Vimentin是一种重要的细胞骨架蛋白，参与细胞黏附、迁移、增殖、凋亡、信号转导、基因组DNA表达等过程，Vimentin基因启动子甲基化与癌前病变和结直肠癌的发生密切相关。2005年，Chen等[7]发现粪便Vimentin甲基化检测筛查结直肠癌敏感性为46%，特异性为90%。目前发现检测粪便APC、ATM、BMP3、CDKN2A、GATA4、GSTP1、HLTF、MLH1、MGMT、NDRG4、RASSF2A、SFRP2、TFPI2、VIM、WIF1等基因甲基化水平异常均可用于结直肠癌的筛查。
结直肠癌本质上是一种多基因、多阶段的分子遗传学改变所引发的疾病，单基因的改变不一定会导致结直肠癌的发生，因此粪便单靶点DNA检测筛查结直肠癌的敏感性低，粪便多靶点基因检测因具备检测多种肿瘤发生相关基因的能力而有较高的敏感性。粪便多靶点DNA检测（MT-sDNA）于2000年由Ahlquist等首先研发，并用于结直肠癌的筛查。Ahlquist等的研究联合检测了APC、K-ras、p53基因和微卫星不稳定的标志物Bat-26，显示MT-sDNA筛查结直肠癌和直径>1 cm腺瘤的敏感性分别为91%和82%[8]，远高于粪便单靶点DNA检测的敏感性。此后，关于MT-sDNA的研究迅速发展。随着理论和技术的不断完善，2008年美国癌症协会（ACS）首次将MT-sDNA纳入结直肠癌筛查推荐指南，但关于筛查间隔时间未有明确规定[9]。2014年，Imperiale等[10]开展的一项入组北美90个地区，约10 000名受试者的大型研究——"Deep-C"，采用"Cologuard"试剂盒联合检测粪便中K-ras基因突变、NDRG4和BMP3异常甲基化、β-actin基因和血红蛋白水平与结直肠癌的关系，结果显示MT-sDNA筛查结直肠癌和进展期癌前病变的敏感性分别为92.3%和42.4%，均优于FIT检测的敏感性73.8%和23.8%。同年美国食品药品监督管理局（FDA）批准"Cologuard"粪便MT-sDNA检测试剂盒用于结直肠癌的临床筛查，每3年检测一次的费用可由医保支付[11]。2016年，美国预防服务工作组（USPSTF）也将MT-sDNA纳入结直肠癌的筛查指南，对于一般风险人群：50岁及50岁以上无结直肠腺瘤病史、无炎症性肠病病史、无结直肠癌家族史的人群，建议每3年进行一次MT-sDNA筛查[12]。
粪便中源自脱落肠上皮细胞的mRNA含量较低，且极易降解。随着提纯和检测技术的发展，粪便中mRNA检测筛查结直肠癌取得了一定的发展。微小RNA（miRNA）是由18~25个核苷酸组成的微小内源非编码RNA，通过抑制转录后翻译或诱导目标mRNA的降解，在转录后水平调控靶基因的表达。目前发现部分miRNA可以充当结直肠癌发生过程的促进剂或抑制剂，影响肿瘤的发生发展、血管生成、侵袭转移、免疫逃逸、代谢异常等过程[13]，在结直肠癌发生的"传统腺瘤"和"锯齿状"途径中均发挥重要调节作用。
环氧合酶2（COX2）在结直肠癌的发生发展和远处转移中发挥作用。2007年，Kanaoka等[14]发现检测粪便中COX2的mRNA水平用于筛查结直肠癌的敏感性和特异性较高，随后发现联合检测粪便中COX2和基质金属蛋白酶7（MMP7）的mRNA水平可以提高检测效率。尽管粪便mRNA检测筛查结直肠癌不断取得进步，但粪便中mRNA的极不稳定性限制了其发展。
miRNA低分子量和独特的茎环结构使其不易被RNA酶降解，且miRNA可存在于外泌体中而稳定性高，完整性好，室温下最高可稳定存在72 h。Ahmed等[15]于2009年首次利用逆转录PCR技术开启了结直肠癌患者粪便miRNA水平的研究。此后，对粪便中miRNA筛查结直肠癌的大量研究结果均提示其为较理想的筛查手段。目前，用于粪便miRNA检测的方法主要包括实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）、基于Taqman的微阵列、深度测序技术和下一代测序技术。2013年，Ahmed等[16]发现结直肠癌患者粪便中miR-7、miR-17、miR-20a、miR-21、miR-92a等促癌miRNA表达升高，而miR-9、miR-29b、miR-127-5p、miR-138、miR-143等抑癌miRNA表达下降。Wu等[17]采集了88例结直肠癌患者、57例结直肠息肉、101名健康人的粪便，使用qRT-PCR分析发现结直肠癌患者粪便中miR-92a和miR-21水平明显高于对照组，粪便miR-92a检测筛查结直肠癌和结直肠息肉的敏感性分别为71.6%和56.1%，特异性为73.3%，但粪便miR-21检测筛查结直肠癌和结直肠息肉的敏感性较低，为55.7%和43.9%，特异性相同。联合检测粪便miR-92a和miR-21可将筛查结直肠癌和结直肠息肉的敏感性提高至81.8%和68.4%。Choi等[18]研究采用qRT-PCR检测29对结直肠癌患者和对照组粪便中miR-92a和miR-144*水平，结果显示粪便中miR-92a和miR-144*筛查结直肠癌敏感性和特异性分别为89.7%和51.7%，78.6%和66.7%。Yoshikatsu等[19]发现联合粪便多靶点miRNA和FIT检测筛查结直肠癌可显著提高检测敏感性至93.3%，FIT单独筛查结直肠癌敏感性为74.4%，表明联合检测粪便miRNA和传统检测方法如FIT是未来结直肠癌筛查的潜在方向。综上，粪便miRNA检测是一种较稳定、重复性好、效价比高的筛查方法，但缺乏大样本、前瞻性的研究证据和标准化试剂盒。
粪便DNA、RNA检测筛查结直肠癌均为非侵入性手段，具有无痛、无创、无需肠道准备等优点，因此有良好的应用前景。下面将重点比较MT-sDNA、粪便miRNA检测的特点。
MT-sDNA检测筛查结直肠癌的敏感性和特异性因研究团队和受试对象的区别而有所出入。"Deep-C"研究中MT-sDNA检测的敏感性为92.3%，特异性为86.6%。Redwood等[20]在美国阿拉斯加州人中开展了与"Deep-C"研究实验设计和检测靶点均相同的MT-sDNA筛查，入组了661名年龄在40~85岁之间的受试者，结果显示筛查结直肠肿瘤（包括结直肠癌和晚期腺瘤）的敏感性为49%，特异性为93%。与结直肠癌发生相关的miRNA数量较多，粪便中不同miRNA检测筛查结直肠癌的敏感性和特异性也存在差异。研究提示，粪便miR-451检测筛查结直肠癌的敏感性为88.2%，特异性高达100%，是目前报道的粪便miRNA检测筛查结直肠癌敏感性和特异性均较高的一项研究，但仅分析了17例结直肠癌患者粪便[21]。Yau等[22]进行了较大规模（198例结直肠癌患者、199例腺瘤患者和198名健康人）的研究，采用qRT-PCR方法检测粪便miR-20a水平，结果显示粪便miR-20a检测筛查结直肠癌的敏感性为55%，特异性为82%。
虽然MT-sDNA筛查价格比较昂贵，但是分析显示，每3年检测一次MT-sDNA，可使结直肠癌发病率降低57%，死亡率降低63%，效价比达11 313$/质量调整生命年（QALY），相比其他的恶性肿瘤筛查方法具有较高的效价比[23]。随着技术的突破，粪便miRNA检测价格相对便宜，但是关于其效价比缺乏大规模样本的分析数据。
（1）价格高：表1为目前常见结直肠癌筛查方法的特性比较。与其他筛查方法相比，MT-sDNA高昂的价格很大程度上限制了其在我国的推广应用。（2）特异性低：FIT筛查结直肠癌的特异性为94.8%[24]，而MT-sDNA检测筛查结直肠癌的特异性为86.6%[25]。特异性低会导致较高的假阳性率和多余的结肠镜检查，给患者带来不必要的身心伤害和经济损失，且缺乏对阳性患者的随访数据导致较难准确评价该筛查方法的利弊[12]，这成为目前MT-sDNA检测亟待解决的问题之一。（3）癌前病变检出率低：尽管MT-sDNA检测结直肠癌的敏感性高，但其对进展期癌前病变的检出率较低，敏感性仅为42%[25]，对预防结直肠癌能力的提升低于预期。粪便miR-92a检测筛查进展期腺癌的能力高于MT-sDNA，敏感性为84.6%[17]。（4）操作较复杂：粪便中99.99%的DNA来源于肠道菌群和食物，仅有0.01%来自人的基因组DNA，其中，1%来自肿瘤细胞。因此，结直肠癌筛查对粪便中DNA的提取和纯化技术要求较高。MT-sDNA检测方法操作复杂，需检测多靶点多基因的异常情况，一定程度上限制了其大规模推广。
（1）稳定性：miRNA稳定性高于mRNA，但是miRNA室温稳定存在时间远低于DNA。Ahmed等通过在粪便标本中加入离散剂可一定程度抑制RNA降解，但当样本较多时可能会影响检测准确性。（2）miRNA靶向性差：一个miRNA能调节多个靶基因的表达，而潜在的癌基因或抑癌基因转录本也可能受到miRNA的调控。因此难以通过单个miRNA水平准确预测结直肠癌的发生与否，联合多靶点粪便miRNA检测或可提高检出率。（3）研究证据不足：目前粪便miRNA的研究多是小样本、回顾性分析，缺乏大样本多中心前瞻性的长期临床试验去验证这些结果，缺乏循证医学数据确定临床粪便miRNA检测筛查结直肠癌的靶点和间隔时间。其原因可能是影响粪便miRNA精确分析的变量较多，如：样品的收集、RNA提取效率以及酶活性等，且miRNA的肿瘤或器官特异性较差，免疫代谢相关因素乃至衰老均可能会影响粪便miRNA水平。
粪便DNA和RNA尤其是MT-sDNA和粪便miRNA检测作为新兴的非侵入性分子水平筛查手段，在结直肠癌的筛查中具有巨大潜力和广阔的应用前景。MT-sDNA具有无创无痛、敏感性高、效价比高等优点，已被列入美国结直肠癌筛查指南，但也存在价格昂贵、特异性低、癌前病变检出率低、操作较复杂等不足。粪便miRNA检测具有敏感性和特异性较高、价格实惠、癌前病变检出率高、操作较简便等优点，但也存在不如DNA稳定、靶向性差、研究证据不足等缺点。我国报道联合MT-sDNA和粪便miRNA-135b检测筛查结直肠癌明显高于单一检测检出率[33]，MT-sDNA、粪便miRNA和FIT联合检测也可明显提高筛查敏感性[19,34]，这些研究提示联合粪便DNA、miRNA检测和传统筛查方法或许是未来结直肠癌筛查的重要方向之一。目前，我国尚未将MT-sDNA、粪便miRNA检测纳入结直肠癌的筛查指南，相信随着"精准医疗"、"全民健康"理念的深入，大众对疾病预防意识的提高、检测技术的改良、医疗保险范围的扩大以及更多大样本、多中心、前瞻性研究数据的支持，检测MT-sDNA和粪便miRNA生物标志物将会成为一种更加科学有效筛查结直肠癌的方法。
所有作者均声明不存在利益冲突
