寻找三阴性乳腺癌（TNBC）研究与治疗的可能靶点，并采用生物信息学对影响TNBC预后的基因进行分析预测。
检索The National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库，分析不同组间差异基因后提交至Enrichr网站进行通路富集，最后进行TNBC患者的生存分析。
去整合素金属蛋白酶9（ADAM9）基因与TNBC患者的预后不良有相关性（P<0.05），且其仅与TNBC患者预后有关，与其他分型乳腺癌无关。
ADAM9基因被证明与TNBC患者的不良预后有关，可将其视为导致TNBC患者淋巴结转移，最终预后不良的可能关键基因。
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乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，其中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体-2（HER-2）3个指标均表达阴性的乳腺癌被称为三阴性乳腺癌（TNBC）[1]。由于多方面因素，TNBC已经成为基础研究人员和临床医生深入研究的重要课题。首先，TNBC发病年龄相对较轻，多数是绝经之前。其次，尽管对化疗的初始良好反应，但与非TNBC相比，TNBC的预后仍然很差。第三，TNBC的肿瘤范围相对偏大，有着显著的侵袭性，通常会伴随淋巴结转移的问题发生。所以，TNBC没有有效的特异性靶向治疗，内分泌治疗与靶向治疗均对其无效，因此治疗手段较为单一[2]。
淋巴结转移是肿瘤转移的最常见形式[3]，同时它对乳腺癌的诊断、分期、治疗方案的选择等均具有重要的参考价值。TNBC也不例外，其中常见的淋巴结转移方式——腋窝淋巴结转移，唯一的治疗方法是腋窝淋巴结清扫术。对于腋窝淋巴结转移患者，不仅其长期预后较腋窝淋巴结阴性患者要差，而且腋窝淋巴结清扫术后长期并发症，包括肩部活动受限、感觉异常、手臂麻木、淋巴水肿等，对患者的生活质量有重要影响[4]。为此，本研究欲通过生物信息学比较并分析TNBC患者中发生淋巴结转移与未发生淋巴结转移的差异基因表达，并筛选出可能导致TNBC患者发生淋巴结转移的最关键基因，为未来精准治疗已发生淋巴结转移的TNBC提供数据支持。
1．资料利用NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中GEO datasets（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）功能，在检索框中输入关键词"triple negative breast cancer"进行检索，在结果返回页中逐个查看每个数据集的详细内容，最终挑选出数据集GSE88847[5]为本次数据分析的对象。
2．GEO数据集的筛选与差异基因的统计：GSE88847包含37例TNBC患者原发肿块的转录组学测序，所采用芯片为Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array。剔除37例患者中淋巴结转移情况不详的患者8例，其余29例患者则分为有淋巴结转移组（LNM）11例和无淋巴结转移组（nLNM）18例，并对两组患者进行GEO2R比对分析，获得全部基因数据，随后筛选出P<0.05的基因，共424个，即为两组差异具有统计学意义的差异基因。
3．Enrichr通路富集：将上述424个差异基因进行分组，其中在LNM组中高表达的定义为高表达组（LNM-H）221个，在LNM组中低表达的定义为低表达组（LNM-L）203个。为了筛选在淋巴结转移的患者中高表达的基因，对LNM-H组基因进行通路富集。利用Enrichr网站（https://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）[6,7]，将需要富集的基因全部提交至网站，在返回结果页中选择GO通路富集结果（GO Biological Process 2018）作为进一步分析的数据。
4．Kaplan-Meier Plotter生存分析：将由上述方法得出的差异基因依次输入Kaplan-Meier Plotter-Breast cancer网站（http://kmplot.com/analysis/index.php?P=service&cancer=breast）[8]，比较基因表达量对乳腺癌患者的无复发生存期（RFS）、总生存期（OS）与无病生存期（DFS）的影响，借此评估差异基因表达量与乳腺癌患者预后的关系。
5．GOBO分析基因表达量与乳腺癌各项相关指标的关系：将由上述方法得出的差异基因依次输入Gene Expression-Based Outcome for Breast Cancer Online网站（http://co.bmc.lu.se/gobo/）[9]，分析基因表达量与乳腺癌患者的ER、PR、HER-2、淋巴结状态、肿瘤组织学分级等因素的相关性。
将由GSE88847数据集中分析得到的LNM-H组中213个基因提交由Enrichr网站进行通路富集，根据综合得分排名（combined score ranking），其中GO通路富集结果显示排名第一的通路是锰离子反应信号通路（combined score：200.6；P=0.002）。锰（Mn）是哺乳动物组织中最丰富的金属之一，其组织重量在0.3 ~ 2.9 mg/kg之间，是发育、繁殖、神经功能、免疫调节和抗氧化防御等多种生理过程所必需的[10]。
富集通路中所包含的基因被进一步富集排序，研究显示其中仅去整合素金属蛋白酶9（ADAM9）与ATP酶阳离子转运13A2（ATP13A2）两种基因与锰离子反应通路有关（图1）。
采用Kaplan-Meier Plotter-Breast cancer网站分别对ADAM9和ATP13A2基因表达量与乳腺癌患者预后进行相关性分析。结果显示ATP13A2表达量越高，患者RFS越长，预测可能是一个抑癌基因（图2）；而ADAM9的表达量越高，患者不仅RFS减少，同时OS与无远处转移生存期（DMFS）也减少，预测ADAM9可能扮演了促癌的角色。因此将ADAM9作为筛选出的最终对象，进行下一步分析。
由Kaplan-Meier Plotter-Breast cancer网站分析得出，ADAM9的表达量对非TNBC（ER+PR+HER2-、ER-PR-HER2+、ER+PR+HER2+）患者的RFS差异均无统计学意义（P>0.05），而在TNBC（ER-PR-HER2-）患者中，ADAM9表达量越高，患者的RFS越短（P<0.05），提示ADAM9基因仅与TNBC有关（图3）。同样，通过GOBO网站分析得到的数据也显示，在ER-的患者肿瘤中，ADAM9表达量明显高于ER+的患者（P<0.01）（图4）。
注：ER为雌激素受体；PR为孕激素受体；HER-2为人表皮生长因子受体-2；TNBC为三阴性乳腺癌
对于乳腺癌而言，除了可以按照免疫组化的ER、PR、HER2三个指标的表达与否进行分型，另一个重要的评估乳腺癌恶性程度的方法就是对乳腺癌细胞进行组织学分级。由Kaplan-Meier Plotter-Breast cancer网站分析得出，ADAM9的表达量对Ⅰ级与Ⅱ级患者的RFS差异均无统计学意义（P>0.05），而在Ⅲ级患者中，ADAM9表达量越高，患者的RFS越短（P<0.05），提示ADAM9基因仅与Ⅲ级乳腺癌有关。同样，通过GOBO网站分析得到的数据也显示，在Ⅲ级患者肿瘤中，ADAM9表达量明显高于Ⅰ级和Ⅱ级的患者（P<0.001）（图5）。
锰离子反应通路在淋巴结阳性的TNBC高表达基因的富集通路中排名最高，同时，锰也是许多金属酶的必需成分，并且是酶的激活剂。2018年，Wang等[11]发现，在病毒感染后，锰从细胞器释放到细胞质中，促进cGAS-STING信号通路的活化，确定了锰在先天免疫激活和宿主抗病毒防御中的作用。这一重大发现为锰在体内的生理功能研究打开了一扇新的窗口，特别是作为免疫调节剂的功能。同时揭示了锰在抗感染、抗肿瘤及免疫佐剂等应用中具有广阔的前景。ADAM9负责编码ADAM家族的成员。该家族成员是结构上与蛇毒分解素相关的膜锚定蛋白，参与了细胞-细胞和细胞-基质相互作用的多种生物学过程，包括受精、肌肉发育和神经发生[12]。ATP13A2负责编码P5 ATP酶亚家族的一个成员，该亚家族能够运输无机阳离子和其他底物。该基因的突变与Kufor-Rakeb综合征（KRS）有关，有帕金森病症状[13]。在此，本研究将对这两个基因进行深度探索。按照病理组织学分级标准，其中Ⅰ级分化程度好，Ⅱ级分化程度中等，Ⅲ级分化程度差。分化程度越差，乳腺癌细胞恶性程度越高，患者预后越差[14]。
生物信息学，是研究生物医学资源中蕴含的重要信息的学科，其核心是通过研究大规模的生物医学大分子数据，包括生物大分子的序列、结构和功能，以及它们之间的相互联系，以解决生物医学问题[15]。21世纪，医学将完成从组织病理学研究模型到分子医学模型的过渡。现代分子生物学技术发展和研究进展在一定程度上从分子本质揭示了疾病潜在的作用方式和发生机制，识别了大量疾病风险基因和分子标志，为进一步阐明重大疾病的发病机制和开发疾病治疗药物奠定了基础[16,17]。
在本次研究中主要采用生物信息学分析，成功筛选出ADAM9基因。ADAM家族成员通常被认为是调节机体稳态和发育的基础蛋白，其异常表达通常被认为与病理状态有关，包括癌症、炎症、糖尿病和阿尔茨海默病等。作为家族成员之一的ADAM9，已经被证明可能与癌症的转移有关，并且似乎在许多人类癌症中显著上调。此外，也有研究表明ADAM9可能参与了人类癌症的发病机制，并可能成为开发抗癌药物的良好治疗靶点[18]。之后利用Kaplan-Meier Plotter-Breast cancer网站与GOBO网站对ADAM9进行分析。经过分析得到，ADAM9基因的表达量与TNBC患者和Ⅲ级乳腺癌患者的预后生存有关，由此可见，ADAM9的表达可能与恶性程度高的乳腺癌相关，从而反映出ADAM9对于未来研究和治疗乳腺癌的重要性。
所有作者均声明不存在利益冲突
