对两个中度感音神经性耳聋小家系行表型及遗传学分析，明确其致聋病因。
对2014年1月至2020年8月间就诊于解放军总医院的两个耳聋小家系进行表型及遗传学分析。对家系1先证者及家系2先证者父母的DNA样本行所有已知耳聋基因二代测序，并对变异位点在家系成员中进行Sanger测序验证。对已报道的耳胶样蛋白（OTOGL）基因致病变异位点、导致中度感音神经性耳聋的常染色体隐性遗传性耳聋基因和与OTOGL基因具有相同表达定位的耳聋基因的临床表型进行分析和总结。
两个耳聋家系先证者（均为男性患儿）的致病变异分别为OTOGL基因c.2773C>T/c.2826C>G（p.Arg925*/p.Tyr942*）和c.4455G>A/c.875C>G（p.Trp1485*/p.Ser292*）复合杂合变异，其中c.2773C>T为文献已报道的致聋变异位点，c.2826C>G、c.4455G>A和c.875C>G为新发现的变异位点，根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）制定的变异解读标准，上述4个变异位点分类均为致病变异。
OTOGL基因变异是导致中度感音神经性聋的重要遗传因素，本研究新发现的c.2826C>G、c.4455G>A和c.875C>G变异位点丰富了该基因的基因变异谱，为耳聋家系的遗传咨询提供了依据，并为遗传性耳聋的治疗提供了新的靶点。
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耳胶样蛋白（otogelin-like，OTOGL）基因，亦称C12ORF64基因，位于12q21.31，共189 719个碱基对，包含68个外显子，是构成内耳非细胞胶质膜的重要非胶原蛋白之一［1］，其变异导致常染色体隐性遗传性耳聋84B型（DFNB84B）。同源分析显示，OTOGL蛋白与耳胶蛋白（otogelin，OTOG）间的同源性和相似度分别为33.3%和56.0%，属于OTOG蛋白家族，其主要结构包括1个羧基端CTCK结构域、4个配对的vWF结构域和C8结构域以及4个TIL结构域［2］。2012年，Yariz等［3］在土耳其的两个非综合征性聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）家系中首次鉴定并报道了OTOGL基因的致病变异。截至目前，已有4个研究团队相继报道了该基因的致病变异，共计7个位点，但不同于大多数隐性遗传基因变异所致的重度或极重度耳聋，已报道的OTOGL基因变异均导致中度感音神经性耳聋［2, 3, 4, 5］。本研究通过对两个先天性中度感音神经性耳聋患者小家系DNA样本行已知耳聋基因二代测序，结合生物信息学分析，明确了其均由OTOGL基因复合杂合变异致病，同时进一步分析了OTOGL基因型与表型的相关性，以期对导致中度耳聋的基因及其变异有更全面的认识。
本研究在解放军总医院聋病分子诊断中心完成，研究对象为2014年1月至2020年8月间到本中心就诊的两个耳聋小家系。家系1，患儿男，出生33 d，新生儿听力筛查未通过，其父母为明确患儿耳聋病因于2018年4月前来就诊，耳声发射（otoacoustic emissions，OAE）检测示双耳均未引出，听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response，ABR）检测左右耳反应阈值分别为40 dB nHL（正常听力级）、50 dB nHL（正常听力级），听觉多频稳态诱发电位（ASSR）检测结果为中度感音神经性耳聋。家系2，患儿男，已诊断中度感音神经性耳聋，其父母拟再生育，前来遗传咨询。家系2患儿1岁时（2014年1月）行OAE检测示双耳均未引出反应，ABR检测结果示左右耳反应阈值分别为50 dBnHL（正常听力级）、60 dBnHL（正常听力级），ASSR结果显示为中度感音神经性耳聋，并于4岁和7岁时复查听力。两家系患儿常规的耳科以及颞骨高分辨率CT检查均未见异常，两家系父母双方听力正常，否认耳聋相关病史、肾病家族史、耳毒性药物应用史、脑膜炎以及外伤史等，家族内均无其他耳聋患者。家系2患儿在外院行常见耳聋基因（GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA基因）检测，Sanger测序结果为阴性。
本研究获得解放军总医院科研伦理委员会批准（S2016-120-02）。患儿1监护人签署知情同意书后，收集一家三口血样。患儿2父母要求全面检测明确再生育是否有风险，就诊时采集该对夫妻血样。对患儿1及患儿2父母行包含168个已知耳聋基因的二代测序。补充采集家系2患儿血样，对所检出变异在所有家系成员中进行一代测序验证。
1. DNA提取和文库的构建：使用DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］从外周血提取基因组DNA。用Nanodrop 2000 （美国ThermoFisher Scientific公司）测定所提取的DNA浓度。用至少3 μg的DNA进行Illumina文库构建，并选择大小为350~450 bp的DNA片段以及接头序列作为DNA文库。
2. 目标基因捕获测序及数据分析：利用GenCap 基因序列捕获技术对两家系患儿的DNA样本进行168个耳聋基因编码区域捕获测序，详细步骤如下：（1）针对168个耳聋基因的外显子非重复区设计生物素化的捕获探针，将1 μg的DNA文库与设计的探针（北京迈基诺基因科技股份有限公司）和BL缓冲液混合，置于ABI-2720 PCR仪（美国ABI公司）中，95℃加热7 min，65℃加热2 min；再加入23 ml预热至65℃的HY缓冲液，于65℃杂交22 h。（2）用500 μl 1×结合缓冲液清洗50 μl MyOne磁珠（美国Life Technology公司）3次，重悬于80 μl 的1×结合缓冲液。随后，加入64 μl 2×结合缓冲液至杂交混合物中，转移至含有80 μl MyOne磁珠的试管中旋转混匀1 h。（3）在室温下用WB1缓冲液清洗磁珠15 min，然后65℃下用WB3缓冲液清洗3次，每次15 min，最后将所捕获的DNA用缓冲洗脱液洗脱，并按照以下步骤进行扩增：98℃预变性30 s；98℃变性25 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行15个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物用固相载体可逆化固定（SPRI）磁珠（美国Beckman Coulter公司）按照产品说明书进行纯化。富集的文库用Illumina HiSeq 3000第二代测序仪进行测序，配对末端读数为150 bp。
测序完成后，使用Bcl2Fastq软件（Bcl2Fastq 2.18.0.12，美国Illumina公司）处理原始图像文件。去除测序数据中的低质量变异数据（质量值≤20），运用短寡核苷酸分析包比对软件（SOAP2.21； soap.genomics.org.cn/soapsnp.html）将clean reads（高质量序列）与参考人类基因组进行比对。使用Picard程序删除PCR重复片段。随后，使用SOAPsnp程序检测单核苷酸多态性（SNP），用Burrows-Wheeler Aligner软件0.7.15重新对齐读长，并使用Genome Analysis Toolkit软件3.7检测缺失和插入（In/Dels）。使用Exome助手程序对已识别的SNP和InDel进行注释。MagicViewer用于查看短读长的对齐方式，并确认候选SNP和In/Dels。最后使用PolyPhen、SIFT、Panther和PMut软件对错义变异进行评估。
针对在受检者样品中所筛查出的可疑致病变异的位置，设计了4对引物，c.875C>G位点引物序列：上游5' TGGCGATAAATGCTTCACTG 3'，下游5' TCTGTCTGACATGCCCACAT 3'；c.4455G>A位点引物序列：上游5' TGTACACCATGGGCA ATATGA 3'，下游5' TCACTTGAACTGGCCTTCCT 3'；c.2826C>G位点引物序列：上游5' TGA ACTGGCAATATTCGTAAGG 3'，下游5' TCAAAA ACACCTGGCAATCA 3'；c.2773C>T位点引物序列：上游5' CCAATGTTGCTGTCACTTGAA 3'，下游5' CAGGGACCAGCATACTTGTTT 3'，用PCR进行相应DNA片段的扩增，并用Sanger测序对扩增产物进行测序，测序结果采用DNASTAR（Madison）软件进行分析，家系其他成员使用相同的方法进行可疑致病位点变异检测。
3. OTOGL基因致病变异和与其具有相同表达定位或临床表型的耳聋基因分析：通过查阅文献进一步对已报道的OTOGL基因致病变异位点、导致中度感音神经性耳聋的常染色体隐性遗传性耳聋相关基因和与OTOGL基因具有相同内耳表达定位的耳聋基因的临床表型进行总结和分析。
4. 氨基酸保守性分析：用UGENE软件对7个同源氨基酸序列（黑猩猩、家犬、牛、家鼠、大鼠、鸡、蟾蜍）与人类OTOGL氨基酸序列进行比对，分析物种进化过程中变异对应氨基酸的保守性（同源氨基酸序列数据库：www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）。
两家系均只包括听力正常的父母和1名患儿（图1）。两家系患儿耳聋表现均为先天性，临床听力学检测均显示为中度感音神经性耳聋（图2），对家系2先证者进行6年随访，未发现听力进展（图2）。两例患者均无其他器官系统异常，考虑为NSHL。
注：家系2患儿2020年听力图为纯音听力测试（PTA）结果，其余为听觉多频稳态诱发电位（ASSR）结果；不同的听力检测方法和条件均可能对听力检查结果产生一定影响，家系2患儿听力随访结果的波幅在中度感音神经性耳聋阈值范围内
对家系1患儿行168个已知耳聋基因外显子捕获测序，综合家系特点（隐性遗传或者为显性遗传新生变异致病）、生物信息学和患者临床表型分析，发现家系1患儿携带的OTOGL基因c.4455G>A/c.875C>G（p.Trp1485*/p.Ser292*）复合杂合变异符合致病条件。该患儿OTOGL基因Sanger测序结果与二代测序结果一致，经家系验证分析，其父母分别为c.4455G>A和c.875C>G杂合变异携带者（图3）。
注：红色箭头标记位置为变异位点；家系1患儿（Ⅱ1）c.4455G>A为反向验证结果
对家系2父母行168个已知耳聋基因外显子捕获测序，根据常染色体隐性遗传杂合变异不足以致病以及父母双方均无耳聋的临床表型，初步判定父母分别携带的OTOGL基因c.2773C>T和c.2826C>G杂合变异有可能为患儿的致病变异。应用Sanger测序对父母双方及患儿进行OTOGL基因变异位点验证，结果发现患儿携带OTOGL基因c.2773C>T/c.2826C>G（p.Arg925*/p.Tyr942*）复合杂合变异（图3），其父母分别为两个变异的携带者。
上述变异在Exac、千人基因组和ESP等正常人群数据库中并未查询到携带。其中，c.2773C>T为已报道的致病变异，c.2826C>G、c.4455G>A和c.875C>G为首次报道，根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）变异解读标准，OTOGL基因的4个变异位点分类均为：PVS1+PM2+PP4（PVS1：致病性很强；PM2：致病性中等；PP4：致病性支持），为致病变异。
本研究总结了前期4个研究团队已报道的OTOGL基因7个致病变异位点，发现OTOGL基因的致聋变异均表现为非进展性，中度感音神经性耳聋，且大多为无义变异（表1）。经检索文献，发现常染色体隐性遗传性耳聋基因STRC、MPZL2、OTOG和OTOGL基因变异后的临床表现几乎完全相同，均为非进展性、中度感音神经性耳聋，而CEACAM16基因变异也会导致中度感音神经性耳聋，但表现为进展性。结合OTOGL基因在内耳的表达定位，笔者还分析了目前已知的编码表达于内耳盖膜的蛋白的致聋基因，结果显示，除OTOG基因与OTOGL基因变异具有相同的临床表型以外，其他耳聋基因（CEACAM16、OTOA、TECTA和COL11A2基因）变异所致的临床表型均不同于OTOGL基因缺陷引起的表型。
OTOGL基因致病变异及其相关表型（包括本研究）
OTOGL基因致病变异及其相关表型（包括本研究）
| 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | 发病年龄（岁） | 耳聋分级 | 表型是否稳定 | 国籍 | ACMG分级 | 文献 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| c.1430delT | p.Val477Glufs*25 | - | 中度 | 是 | 土耳其 | PVS1+PS3+PM2+PP1+PP4 | [3] |
| c.547C>T | p.Arg183* | 语前 | 中度 | 是 | 荷兰 | PVS1+PS3+PM2+PP1+PP4 | [3] |
| c.5238+5G>A | - | 语前 | 中度 | 是 | 荷兰 | PM2+PS3+PP1+PP4 | [3] |
| c.1558C>T | p.Gln520* | 5 | 中度 | 是 | 法国 | PVS1+PM2+PP4 | [4] |
| c.2773C>T | p.Arg925* | 5 | 中度 | 是 | 法国 | PVS1+PM2+PP4 | [4] |
| c.6467C>A | p.Ser2156* | 7，9 | 中度 | 是 | 中国 | PVS1+PM2+PP1+PP4 | [2] |
| c.6474dupA | p.Ser2159Metfs*2 | 7，9 | 中度 | 是 | 中国 | PVS1+PM2+PP1+PP4 | [2] |
| c.2773C>T | p.Arg925* | - | 中度 | 是 | 叙利亚 | PVS1+PM2+PP1+PP4 | [5] |
| c.2773C>T | p.Arg925* | 语前 | 中度 | 是 | 中国 | PVS1+PM2+PP4 | 本研究 |
| c.2826C>G | p.Tyr 942* | 语前 | 中度 | 是 | 中国 | PVS1+PM2+PP4 | 本研究 |
| c.4455G>A | p. Trp1485* | 语前 | 中度 | - | 中国 | PVS1+PM2+PP4 | 本研究 |
| c.875C>G | p. Ser292* | 语前 | 中度 | - | 中国 | PVS1+PM2+PP4 | 本研究 |
注：ACMG为美国医学遗传学与基因组学学会；PVS1（致病性很强）：无功能变异（无义突变、移码突变、经典±1或2的剪接突变，起始密码子变异单个或多个外显子缺失）；PS3（致病性强）：体内、体外功能实验已明确会导致基因功能受损的变异；PM2（致病性中等）：ESP数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异（或隐性遗传病中极低频位点）；PP1（致病性支持）：变异与疾病在家系中共分离（在家系多个患者中检测到此变异）；PP4（致病性支持）：携带变异的患者表型高度符合OTOGL基因变异导致的中度感音神经性耳聋；-示氨基酸改变、发病年龄或表型是否稳定尚不清楚
UGENE软件保守性分析结果显示，已报道的OTOGL基因变异对应氨基酸位点（包括本研究）p.Arg183、p.Ser292、p.Val477、p.Gln520、p.Arg925、p.Try942、p.Trp1485、p.Ser2156和p.Cys2159在同源物种间呈高度保守（图4）。
耳聋是由多种病因导致的听觉功能障碍性疾病，常见病因包括遗传、感染和外伤等［6］。遗传性耳聋是人类耳聋的主要类型之一，约占耳聋的50%以上，并且有超过70%的遗传性耳聋患者为NSHL（主要表现为不伴随其他器官和系统异常，仅出现听觉功能障碍）［7］。截至目前，共计121个与NHSL相关的基因被报道，其中与常染色体隐性遗传相关的耳聋基因占比最大，共有76个，其次为49个常染色体显性遗传耳聋基因和5个X-连锁遗传耳聋基因（http：//hereditaryhearingloss.org，网站更新日期2020年4月20日）。然而，不同于上述绝大多数常染色体隐性遗传性耳聋基因变异所致的重度或重度-极重度感音神经性耳聋［8］，本研究在两个临床表现为双耳中度感音神经性耳聋的患者中首次发现OTOGL基因c.4455G>A/c.875C>G（Trp1485*/p.Ser292*）和c.2773C>T/c.2826C>G（p.Arg925*/p.Tyr942*）的复合杂合变异，其中c.2826C>G、c.4455G>A和c.875C>G为新发致病变异位点，以上4个变异分别来自2例患者的父母，且父母双方听力正常，符合常染色体隐性遗传模式。此外，通过总结前期已报道的OTOGL基因7个变异位点和相关临床表型，本研究发现OTOGL基因的致聋变异均表现为非进展性、中度感音神经性耳聋，这与家系2患儿长达6年的听力随访结果相同。
笔者查阅了所有ARNSHL基因变异导致的临床表型，发现STRC、MPZL2、OTOG和OTOGL基因变异后的临床表型几乎完全相同，均为非进展性、中度感音神经性耳聋，CEACAM16基因变异也会导致中度感音神经性耳聋，但表现为进展性［9, 10］。此外，部分携带GJB2、GJB6、MYO7A和CABP2基因变异的患者也会表现为中度感音神经性耳聋［10, 11, 12］。OTOG是一种在内耳非细胞膜结构内高表达的糖蛋白，主要分布于盖膜、外毛细胞和Claudius细胞等部位，该蛋白与OTOGL在蛋白结构、分布和生物学功能上高度相似，均为静纤毛顶端与盖膜连接的重要基质［2， 13］。目前的研究表明，Otog-/-和Otogl-/-小鼠表现为先天性轻至中度听力损失，同时扫描电镜和免疫荧光结果显示，基因敲除小鼠内耳毛细胞顶端纤毛束的形状发生了一定改变，且毛细胞顶端的静纤毛与盖膜之间的连接出现缺失［14］，由于OTOG或OTOGL基因所表达的蛋白在结构和功能上高度相似，且两者变异均能导致耳聋的发生，因此有研究认为OTOG蛋白和OTOGL蛋白在功能上很可能无相互代偿作用［3］。
盖膜在听觉系统中起着至关重要的作用，它独特的生物力学特性对于听觉在耳蜗内的形成和传导至关重要［2］。目前已发现OTOG、CEACAM16、OTOA、TECTA和COL11A2基因同样为编码表达于内耳盖膜的蛋白的致聋基因，依次编码的蛋白OTOG、CEACAM16、Otoancorin、Alpha-tectorin和Collagen11-A4是维持盖膜正常结构和功能的重要成分，然而除OTOG基因以外，上述基因变异所致的临床表型与OTOGL基因相比差异显著，如OTOA、TECTA和COL11A2基因的变异会导致极重度感音神经性耳聋［10， 15］，CEACAM16基因的变异会导致进展性、中度感音神经性耳聋［15］。这些临床表现上的差异可能与不同基因的功能有关，需进一步研究证实。
氨基酸序列在多个同源蛋白质中的保守性意味着其功能的重要性，通常认为氨基酸序列保守性好即表示蛋白功能重要性相对较高［16］。本研究通过氨基酸保守性分析发现OTOGL基因的已知致病变异对应的氨基酸位点在物种间呈高度保守，证明这些位点是OTOGL蛋白的重要功能位点，对该蛋白发挥正常功能起着重要作用。此外，研究发现敲除该基因的小鼠，除内耳毛细胞静纤毛等细微结构发生改变，暂未发现其他与听觉相关细胞的形态或功能学的异常［14］。这些结论与其变异导致的中度听力损失的临床表型相符合。
本研究为两个中度感音神经性耳聋家系明确了分子病因，发现其均为OTOGL基因复合杂合致病变异致聋；报道了OTOGL基因3个新变异位点，对其中1例患者进行了长达6年的听力随访，发现OTOGL基因变异致聋患者听力无明显加重趋势；总结归纳了导致中度感音神经性耳聋的常染色体隐性遗传致病基因，为中度感音神经性耳聋的分子诊断及治疗干预提供了详实数据。本研究具有一定的局限性，如尚未对大样本耳聋患者进行OTOGL基因分子流行病学调查，尚未在听力正常人群进行OTOGL基因致病变异携带率分析，针对上述两点的深入研究有助于全面了解OTOGL基因缺陷对耳聋的作用。
所有作者均声明不存在利益冲突
