建立四跨膜蛋白7自身抗体（TSPAN7A）的荧光素酶免疫共沉淀检测技术（LIPS），并评估TSPAN7A在中国1型糖尿病（T1D）人群中的应用价值。
将插入人全长四跨膜蛋白7 cDNA的海肾荧光素酶重组质粒转染293T细胞，获得含四跨膜蛋白7与海肾荧光素酶融合蛋白的细胞裂解液。待测血清与该细胞裂解液孵育过夜后，用蛋白A-琼脂糖沉淀免疫复合物，洗涤，加入海肾荧光素酶底物并检测荧光读数，以199名健康对照的第99百分位数作为阳性阈值。采用LIPS法检测2014至2017年中南大学湘雅二医院代谢内分泌科就诊的100例T1D患者［男64例，女36例，年龄（28±16）岁］、119例2型糖尿病（T2D）患者［男78例，女41例，年龄（47±12）岁］以及98名健康对照［男55名，女43名，年龄（28±12）岁］血清中TSPAN7A水平。同时采用放射配体法（RLA）检测谷氨酸脱羧酶自身抗体（GADA）、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体（IA-2A）、锌转运体8自身抗体（ZnT8A）水平，初步评估TSPAN7A的临床应用价值。
100例T1D患者中GADA、IA-2A、ZnT8A、TSPAN7A的阳性率分别为72.0%、40.0%、29.0%、25.0%，经Bonferroni法校正后，TSPAN7A阳性率低于GADA（P<0.001），而与IA-2A（P=0.035）和ZnT8A比较差异无统计学意义（P=0.630）。T1D患者TSPAN7A阳性率高于T2D的0.84%（1/119；25.0%比0.84%，P<0.001）和健康对照的1.02%（1/98；25.0%比1.02%，P<0.001）。在其他抗体基础上联合检测TSPAN7A可使T1D抗体阳性检出率由82.0%提高至85.0%。TSPAN7A阳性T1D患者与其他3种胰岛自身抗体阳性者临床特征差异均无统计学意义（均P>0.05）。
本研究成功建立了TSPAN7A的荧光素酶免疫共沉淀检测技术，TSPAN7A是中国T1D人群的一种新型胰岛抗体。
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四跨膜蛋白7（tetraspanin 7）是四跨膜蛋白超家族中的一员［1］，分布在包括大脑、肺和胰腺等全身多处组织中［2］；而在胰腺其特异性表达于胰岛细胞中［3］。新近国际有研究报道四跨膜蛋白7自身抗体（tetraspanin 7 autoantibodies，TSPAN7A）存在于白种人1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）患者中，阳性率19%~43%［4, 5, 6］，提示其对于T1D的诊断、鉴别诊断、预后判断可能有一定的临床意义。本文拟建立TSPAN7A的荧光素酶免疫共沉淀法检测技术（luciferase immunoprecipitation system，LIPS），并研究TSPAN7A在中国糖尿病人群中的分布规律，初步评价其对T1D的应用价值。
1. T1D患者：100例，其中男64例，女36例，年龄2~67（28±16）岁，病程<1年，来源于2014至2017年中南大学湘雅二医院内分泌科门诊和病房患者。纳入对象需符合1999年世界卫生组织（WHO）糖尿病诊断标准，病程1年以内，并基于以下标准进行临床诊断［7］：（1）自发酮症及酮症酸中毒倾向；（2）依赖胰岛素控制血糖；（3）胰岛功能差（空腹C肽<300 pmol/L，餐后2 h C肽<400 pmol/L）；（4）胰岛自身抗体阳性。
2. 2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）患者：119例，其中男78例，女41例，年龄15~78（47±12）岁，病程<1年，来源于2014至2017年中南大学湘雅二医院内分泌科门诊患者。纳入标准：（1）符合1999年WHO糖尿病诊断标准；（2）病程在1年以内；（3）血清谷氨酸脱羧酶自身抗体（glutamic acid decarboxylase autoantibodies，GADA）阴性。排除标准：（1）特殊类型和继发性糖尿病；（2）合并其他自身免疫性疾病；（3）合并肝肾功能不全；（4）合并恶性肿瘤。
3. 健康对照：来源于2014至2017年中南大学湘雅二医院体检人群，均进行口服75 g葡萄糖耐量试验且空腹及餐后2 h血糖结果均正常。排除标准：（1）患有自身免疫性疾病；（2）目前患有感染性疾病；（3）处于妊娠状态；（4）在过去7 d内曾使用免疫抑制剂或糖皮质激素；（5）患有恶性肿瘤；（6）一级亲属患有糖尿病。分为两组，199名健康对照：男89名，女110名，年龄16~72（43±13）岁，用于TSPAN7A检测技术建立阳性阈值；98名健康对照：男55名，女43名，年龄14~59（28±12）岁，用于TSPAN7A健康对照阳性率比较。所有研究对象均空腹抽取肘静脉血。
本研究方案经中南大学湘雅二医院伦理委员会批准［（2014）伦理［科］审第（32）号］，所有观察对象均自愿参加并签署知情同意书。
0.22 μm孔径96孔微孔滤膜板（德国默克Millipore公司），无IgG牛血清白蛋白（上海翊圣生物科技有限公司），0.2 ml离心管（美国康宁公司），Fugene转染试剂（美国Promega公司），蛋白A琼脂糖（美国Invitrogen公司），Renilla-Glo荧光素酶分析试剂盒（美国Promega公司），Glo-Lysis细胞裂解液（美国Promega公司），质粒抽提试剂盒（美国Zymo公司），胎牛血清（美国Gibco公司），Tris缓冲盐溶液（含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、0.05% Triton X100和0.1%吐温20，用盐酸调节pH为7.2），TSPAN7A（美国Abcam公司），聚偏二氟乙烯膜（美国GE公司），ECL显影液（美国Advansta公司）。主要仪器：多功能液体闪烁计数发光分析仪（MicroBeta LumiJET型，美国PerkinElmer公司）。
1. 质粒构建和扩增：四跨膜蛋白7全长片段（美国Origene公司）经PCR扩增后克隆入pRen-2海肾荧光素酶表达质粒。重组质粒转化宿主菌E.coli.DH10。测序验证后的阳性菌落培养在100 ml LB（Luria-Bertani）培养基中过夜，采用Maxiprep质粒抽提试剂盒纯化质粒。
2. 体外转录与翻译：按照说明书，用Fugene6转染试剂将质粒转染进293T细胞，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养48 h后使用Glo-Lysis裂解细胞，并收集细胞裂解液。
3. 四跨膜蛋白7蛋白表达检测：使用Western印迹法检测转染后293T细胞裂解液四跨膜蛋白7的蛋白表达情况。
4. LIPS：取5 μl血清与25 μl含有上述细胞裂解液（荧光强度为1×106）的Tris缓冲盐溶液混合后4 ℃孵育过夜。随后将混合液转移至96孔微孔滤膜板中，加入20 μl蛋白A琼脂糖（含0.1%无IgG牛血清白蛋白），4 ℃振荡避光孵育1 h（300转/s）。随后使用200 μl Tris盐缓冲液洗涤96孔板10次。洗涤完毕后加入荧光底物，10 min后采用多功能液体闪烁计数发光分析仪测定荧光计数，单位为每秒计数（counts per second，CPS）。使用1例具高水平免疫沉淀反应的T1D患者血清作为阳性对照，1名健康对照血清作为阴性对照。TSPAN7A指数=（样本CPS-阴性对照CPS）/（阳性对照CPS-阴性对照CPS）。阳性判定标准：采用199名健康人TSPAN7A指数的第99百分位数0.024作为阳性阈值。信-噪比（S/N值）=阳性标准血清CPS/阴性对照血清CPS。每批标本检测成功标准：S/N≥15。每份样本均进行双管检测。阳性标本均进行竞争抑制实验以避免假阳性出现。该方法批内变异系数为6.3%~12.4%，批间变异系数为14.9%~35.7%。
5. 三种胰岛自身抗体测定：采用本实验室建立的放射配体法［8］。2016年参加国际糖尿病免疫学会和美国佛罗里达大学共同举办的胰岛自身抗体国际标准化评估（IASP 2016）显示GADA灵敏度82.0%，特异度97.8%；蛋白酪氨酸磷酸酶-2自身抗体（protein tyrosine phosphatase-2 autoantibodies，IA-2A）灵敏度76.0%，特异度100%；锌转运体8自身抗体（zinc transporter 8 autoantibodies，ZnT8A）灵敏度72.0%，特异度100%。
6. 其他：采用日立7070型全自动生化分析仪检测空腹和餐后2 h血糖，Bayer Centaur Immunoassay System化学发光仪（德国Bayer公司）检测空腹和餐后2 h C肽水平。
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布采用表示，多组间比较采用单因素方差分析；非正态分布计量资料使用M（Q1， Q3）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。计数资料采用例数和百分比表示，组间比较采用χ²检验，两两比较采用Bonferroni法校正检验水准。相关性分析使用Spearman相关分析。均为双侧检验，检验水准α=0.05。
1. 四跨膜蛋白7融合蛋白的表达：对转染不同质粒的293T细胞裂解液进行Western印迹检测，结果显示海肾荧光素酶-四跨膜蛋白7融合蛋白和无标签四跨膜蛋白7蛋白均成功表达（图1）。
注：A为未转染质粒细胞裂解物；B为不含海肾荧光素酶四跨膜蛋白7细胞裂解物；C为不含四跨膜蛋白7空质粒细胞裂解物；D为含海肾荧光素酶四跨膜蛋白7细胞裂解物
2. T1D、T2D以及健康对照中TSPAN7A的阳性率：T1D患者TSPAN7A阳性率（25.0%）高于T2D的0.84%（1/119）和正常人群的1.02%（1/98）（均P<0.001）。
3. T1D患者GADA、IA-2A、ZnT8A、TSPAN7A的阳性率：100例T1D患者中，GADA、IA-2A、ZnT8A、TSPAN7A阳性率分别为72.0%、40.0%、29.0%和25.0%。TSPAN7A阳性率低于GADA（P<0.001），与IA-2A和ZnT8A比较阳性率差异均无统计学意义（P=0.035、0.630>0.017）。
4. T1D患者GADA、IA-2A、ZnT8A、TSPAN7A的重叠率：25例TSPAN7A阳性的T1D患者，合并GADA阳性者21例，占84%；合并IA-2A阳性者15例，占60%；合并ZnT8A阳性者14例，占56%。单独TSPAN7A阳性者3例，占12%。
5. 联合检测结果：在GADA、IA-2A、ZnT8A基础上，联合TSPAN7A抗体检测可使T1D患者抗体阳性率由82%提高至85%（表1，图2）。
T1D患者胰岛自身抗体联合检测的阳性率
T1D患者胰岛自身抗体联合检测的阳性率
| 抗体组合方式 | 阳性例数 | 阳性率（%） |
|---|---|---|
| GADA | 72 | 72 |
| IA-2A | 40 | 40b |
| ZnT8A | 29 | 29b |
| TSPAN7A | 25 | 25b |
| GADA+ZnT8A | 77 | 77 |
| GADA+IA-2A | 80 | 80 |
| GADA+IA-2A+ZnT8A | 82 | 82 |
| GADA+IA-2A+ZnT8A+TSPAN7A | 85 | 85a |
注：T1D为1型糖尿病；GADA为谷氨酸脱羧酶自身抗体；IA-2A为蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体；ZnT8A为锌转运体8自身抗体；TSPAN7A为四跨膜蛋白7自身抗体；与GADA单独检测的阳性率比较，aP<0.05，bP<0.001
注：100例T1D患者，抗体阴性15例；T1D为1型糖尿病；GADA为谷氨酸脱羧酶自身抗体；IA‑2A为蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体；ZnT8A为锌转运体8自身抗体；TSPAN7A为四跨膜蛋白7自身抗体
6. 相关性分析：抗体指数相关性分析显示，TSPAN7A与ZnT8A存在正相关（r=0.218，P=0.029），而与GADA和IA-2A没有显著相关性（P=0.261、0.103）。
7. 临床特征比较：通过对GADA、IA-2A、ZnT8A、TSPAN7A四种胰岛自身抗体阳性T1D人群临床特征分析，发现四组间患病年龄、病程、体质指数（BMI）、空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹C肽和餐后2 h C肽差异均无统计学意义（均P>0.05，表2）。
不同胰岛自身抗体阳性T1D患者临床特征
不同胰岛自身抗体阳性T1D患者临床特征
| 特征 | GADA（n=72） | IA-2A（n=40） | ZnT8A（n=29） | TSPAN7A（n=25） | F/χ2/H值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 男性a | 45（63） | 19（48） | 15（52） | 14（56） | 2.623 | 0.453 |
| 患病年龄（岁）b | 26（14，41） | 18（10，47） | 17（11，32） | 28（14，47） | 3.585 | 0.310 |
| 病程（月）b | 2（1，5） | 2（1，5） | 2（1，4） | 3（1，5） | 1.263 | 0.738 |
| BMI（kg/m2）c | 19.2±3.2 | 18.7±2.8 | 18.2±2.9 | 18.7±2.5 | 0.914 | 0.436 |
| FBG（mmol/L）b | 6.7（6.0，11.3） | 6.7（6.2，8.9） | 7.1（6.2，12.1） | 7.1（6.3，12.1） | 1.746 | 0.627 |
| PBG（mmol/L）b | 13.6（8.9，17.2） | 14.1（8.9，17.3） | 12.2（9.1，17.2） | 13.7（9.6，17.0） | 0.089 | 0.993 |
| FCP（pmol/L）b | 89（34，159） | 92（29，159） | 142（68，216） | 129（19，171） | 3.693 | 0.297 |
| PCP（pmol/L）b | 173（84，310） | 212（85，387） | 294（113，418） | 214（90，381） | 2.562 | 0.464 |
注：BMI为体质指数；FBG为空腹血糖；PBG为餐后2 h血糖；FCP为空腹C肽；PCP为餐后2 h C肽；a 例（%）；bM（Q1，Q3）；c
T1D是指因胰岛β细胞破坏而导致胰岛素绝对缺乏，进而需依赖胰岛素治疗的糖尿病［9］。T1D大多数是由自身免疫所介导，而胰岛自身抗体是β细胞遭受免疫破坏的标志物。目前已发现四种主要的胰岛自身抗体：GADA、IA-2A、胰岛素自身抗体（insulin autoantibodies，IAA）和ZnT8A［10］。而TSPAN7A是国际上新近发现的，对自身免疫糖尿病具有潜在分型诊断价值的胰岛自身抗体。四跨膜蛋白7属于四跨膜蛋白超家族的一员，TSPAN7A在高加索人群T1D中的阳性率为19%~43%，其在中国T1D患者中的阳性率值得研究。
四跨膜蛋白7的氨基酸链跨越细胞膜四次，膜外具有两个糖基化结构域，这为研发TSPAN7A的检测技术带来很大的困难。四跨膜蛋白7具有疏水的特性，而四次跨膜导致抗原纯化较为困难，并且目前的体外转录翻译体系难以形成具有抗原结合表位的空间构象，上述原因共同造成了使用放射配体法和酶联免疫吸附法检测TSPAN7A难以成功［11］。因此，探寻其他能高效检测TSPAN7A的方法就显得十分重要。
近年来，国际上建立了一种新的自身抗体检测方法，即LIPS［12］。LIPS的基本原理是通过构建含有海肾荧光素酶和目的抗原的表达载体，通过真核细胞表达该融合蛋白，裂解细胞后得到含有该融合蛋白的细胞裂解液，将其与待检血清共同孵育以形成抗原抗体复合物。随后加入蛋白A琼脂糖，与抗体IgG结合，形成海肾荧光素酶-目的抗原-抗体-蛋白A琼脂糖复合物，最后加入荧光素底物进行发光并被仪器所检测。使用该方法无需纯化抗原，具有便捷性、检测成本低和无放射性等优点。本研究成功构建了海肾荧光素酶-四跨膜蛋白7共表达和四跨膜蛋白7的两种真核载体，并且均在293T细胞中成功表达。为避免抗原抗体间非特异性结合所致假阳性，本研究同时进行了竞争抑制实验，只有被有效抑制才认为是TSPAN7A阳性。研究显示，建立的表达系统以及LIPS检测技术能成功地检测TSPAN7A。
本研究结果显示，TSPAN7A在T1D患者中阳性率为25%。Walther等［5］使用同样的检测方法在高加索人群中报道的阳性率为27%，与本研究结果接近，初步提示该抗体在人群中分布无明显种族差异。本研究中TSPAN7A阳性率低于IA-2A和GADA，但与ZnT8A阳性率差异无统计学意义，提示其可能在自身免疫糖尿病分型诊断中发挥与ZnT8A相似的作用，属于第三类重要自身抗体（国内外公认第一为GADA，第二为IA-2A）。通过联合TSPAN7A抗体检测可使T1D患者抗体阳性率由先前的82%提高至85%，提示联合检测TSPAN7A对提高自身免疫性T1D诊断率价值有限。
本研究进一步对TSPAN7A阳性的T1D患者临床特征进行分析，发现空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹C肽和餐后2 h C肽与其他胰岛自身抗体阳性患者无差异统计学意义，提示该自身抗体与其他自身抗体在对临床特征的预测上并无差别。但需注意的是各组间抗体阳性重叠率较高，尚需更大样本来分析单一胰岛自身抗体阳性患者间的临床特征差异。
既往研究表明ZnT8A与IA-2A存在相关性［13］，本研究显示TSPAN7A与ZnT8A存在相关，推测可能原因为四跨膜蛋白7与ZnT8均为膜蛋白，在细胞受到破坏后均可释放入血引发免疫反应；与GADA与IA-2A无相关性，尚需扩大样本量进一步证实。
本研究也存在一定的不足。本研究为横断面研究，未能对TSPAN7A与T1D患者胰岛功能的变化和对T1D发病的影响进行长期的随访观察。其次，本研究纳入的T1D人群包括部分已使用胰岛素的患者，因而未能探讨TSPAN7A与IAA的关系，有待在后续研究中进一步完善。此外，TSPAN7A在其他自身免疫性疾病中是否有诊断价值尚需进一步研究。
综上所述，本研究建立了TSPAN7A的LIPS检测技术。TSPAN7A是中国T1D人群的一种新型胰岛抗体。
所有作者均声明不存在利益冲突
