探讨细胞增殖核抗原（Ki67）、细胞角蛋白19（Ck19）在肝细胞癌（HCC）中的表达，研究其与HCC临床病理特征和磁共振成像表观扩散系数（ADC）值的相关性。
回顾性收集2014年1月至2019年10月在郑州大学附属肿瘤医院就诊的203例HCC初诊患者的资料，分析所有患者癌组织中Ki67及Ck19的表达和ADC值，以及Ki67和Ck19与患者临床病理特征的关系，并计算与ADC值的差异及相关性。
Ki67表达阳性和阴性组间的HCC脉管癌栓、甲胎蛋白（AFP）、肿瘤分化程度、复发、淋巴结转移差异有统计学意义（χ²=5.156、12.741、29.925、3.963、77.408，均P<0.05），与ADC值呈负相关（r=-0.214，P=0.002），低Ki67组患者HCC肿瘤的平均ADC值明显高于高Ki67组（1 089±280比1 009±212，P<0.05）；Ck19表达阳性、阴性组间脉管癌栓、AFP、复发、淋巴结转移差异有统计学意义（χ²=9.058、27.034、4.053、14.187，均P<0.05），与ADC值无相关性（r=0.062，P=0.380）。Ki67、Ck19表达在HCC复发时间不同分组之间的差异有统计学意义（均P<0.05）。
Ki67及Ck19在HCC中的异常表达与HCC术后预后、复发有相关性。Ck19与ADC值之间无相关性，Ki67与ADC值呈负相关，提示ADC值对于术前HCC生物学特性能够提供一定的影像学依据。
肝细胞癌（HCC）在全球恶性肿瘤发病率占第六位，死亡率占第二位，占所有癌症死亡人数的9%［1］。有研究证实［2, 3, 4］，HCC的组织学分化程度是预测其手术切除后复发的最主要因素，肿瘤病理分级越高，其术后复发率就越高。HCC的发生、发展是一个多阶段、多因素参与的过程，涉及到癌基因和抑癌基因的调节失调。至今还没有一种方法能提供关于患者诊断、预后、治疗效果的完整信息［5, 6］。细胞增殖核抗原（Ki67）是一种增殖细胞相关抗原，是反映细胞增殖活性的敏感指标，在多种恶性肿瘤中呈现过表达现象。有学者［7］认为，细胞角蛋白19（Ck19）的阳性表达可以加强细胞的增殖与侵袭性，并增加肿瘤的恶性程度，是患者预后不良的一种因素。目前，对于胶质瘤、乳腺癌等肿瘤组织中Ki67的表达与磁共振成像表观扩散系数（ADC）值之间的相关性研究仍存在争议，而对于HCC组织中Ki67、Ck19与ADC值之间相关性研究在国内报道较少。本研究旨在通过回顾性分析203例HCC患者的临床病理资料，研究Ki67、Ck19的表达与HCC患者临床病理特征的关系，并初步分析Ki67、Ck19与ADC值的相关性，以探讨两者在HCC中的临床意义。
本文为横断面研究，回顾性收集2014年1月至2019年10月间在郑州大学附属肿瘤医院就诊的HCC初诊患者资料。纳入标准：（1）近期无服用肝毒性药物史；（2）术前无抗肿瘤治疗或手术治疗史；（3）切缘无肉眼可见的残留癌肿。排除标准：（1）图像质量差，影响ADC值测量；（2）不能耐受屏气者；（3）无手术病理结果者。共203例HCC患者纳入研究，男163例，女40例；年龄25~76（55±9）岁。所有患者均经过手术病理证实。分析所有患者的临床资料，203例患者中，有58例患者病理结果缺少分化程度的诊断，剩余145例HCC患者根据肿瘤分化程度分为3组：低分化组49例，中分化组67例，高分化组29例。203例HCC病例，经过6~36个月随访，获得完整随访资料175例，失访28例；复发病灶经过病理或穿刺确诊，或综合介入治疗、临床及影像学表现、最短6个月以上的随诊确定，最终96例患者确定复发，无复发79例。所有患者知情同意豁免。本研究符合《赫尔辛基宣言》对伦理的要求。
受试者影像资料均通过 3.0T磁共振（德国西门子公司）采集，18-通道腹部相控阵线圈，内置32-通道脊柱矩阵线圈，取头先进的仰卧位。检查前禁饮食6 h。检查序列包括：屏气T1加权像（T1WI）正反相位序列，T2加权像（T2WI）抑脂序列及弥散加权成像（DWI）序列，以及多动脉期（MA）-卷褶控制更快加速并行成像（CAIPIRINHA）、水脂分离（Dixon）及时间分辨交叉随机轨迹成像（TWIST） （CDT）-容积内插体部检查（VIBE）序列（MA-CDT-VIBE序列）。行MA-CDT-VIBE动态采集时，高压注射器经肘静脉以2.5 ml/s流率注射对比剂钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）共0.1 mmol/kg，分别于注入对比剂后12 s采集6期动脉期图像，50 s采集门静脉期图像，90 s、150 s及5 min采集平衡期图像。
由2名具有5年以上工作经验的放射科主治医师独立盲法在203例HCC癌肿ADC图像上测量ADC值。参考平扫加动态增强图像，感兴趣区（ROI）选取肿瘤的实性部分，尽量避开肿瘤边缘、大血管及肉眼可辨的囊变、坏死区。在肿瘤最大径的层面上，选取3个位置不同的圆形ROI，面积10~40 mm2，测量3次，取平均值。
常规处理标本，病理结果判定：Ki67阳性着色为细胞核出现棕黄色颗粒，以肿瘤细胞不着色或<10% 的肿瘤细胞着色为阴性（-），≥10%的肿瘤细胞着色为阳性（+/++）。Ck19以细胞膜和细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，以肿瘤细胞无着色或阳性信号定位不明确为阴性（-）；以肿瘤细胞弥漫或散在阳性颗粒为阳性（+）。计算Ki67标记指数，即随机选取10个高倍视野，计数1 000个肿瘤细胞中阳性细胞的比例；以50%为界，将患者分为低Ki67组（Ki67<50%）和高Ki67组（Ki67≥50%）。
采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、切缘受侵情况、脉管癌栓、甲胎蛋白（AFP）正常与否、肿瘤分化程度、肿瘤复发情况、淋巴结转移情况、肝内转移情况均为计数资料，以率和频数表示，两组间比较采用χ²检验。低Ki67组和高Ki67组的ADC值符合正态分布以表示，两组间比较采用独立样本t检验。不同复发时间肿瘤的Ki67、Ck19阳性及阴性表达例数为计数资料，组间比较采用χ²检验。采用Spearman相关性分析Ki67、Ck19表达与ADC值的相关性。绘制受试者工作特征曲线（ROC）确定低Ki67组肿瘤的ADC诊断界值，计算曲线下面积（AUC），通过约登指数（Youden index）法确定灵敏度和特异度。双侧检验，检验水准α=0.05。
203例HCC患者中，181例Ki67的表达为阳性，占比89%（181/203）；60例Ck19的表达为阳性，占比30%（60/203）；将Ki67和Ck19的表达与HCC患者的临床病理特征（性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、切缘情况、脉管癌栓、AFP、肿瘤分化程度、复发、淋巴结转移、肝内是否转移）进行分析，结果显示Ki67表达阳性、阴性组间HCC脉管癌栓、AFP、肿瘤分化程度、复发、淋巴结转移差异有统计学意义（χ²=5.156、12.741、29.925、3.963、77.408；均P<0.05），其他临床病理特征在Ki67表达阳性、阴性组间差异均无统计学意义（χ²=0.893、0.052、0.586、0.327、0.634、1.049；均P>0.05）。Ck19表达阳性、阴性组间脉管癌栓、AFP、复发、淋巴结转移差异有统计学意义（χ²=9.058、27.034、4.053、14.187；均P<0.05），其他临床病理特征在Ck19表达阳性、阴性组间差异均无统计学意义（χ²=0.234、0.613、0.986、2.120、3.209、0.001、2.787；均P>0.05）（图1, 2, 3）。
Ki67的表达与ADC值之间呈负相关（r=-0.214，P=0.002）； Ck19的表达与ADC值之间无相关性（r=-0.062，P=0.380）。低Ki67组患者HCC肿瘤的平均ADC值高于高Ki67 组患者［（1 089±280比1 009±212），t=2.309，P=0.022］。低Ki67肿瘤的ADC诊断界值为0.436×10-3 mm2/s，灵敏度和特异度分别为93%和51%，AUC为0.74。
175例有随访结果患者中，确诊复发96例，复发率为55%（96/175），Ki67及Ck19在复发患者的阳性表达率分别为92%（88/96）、35%（34/96）。将所有复发患者按照复发时间分为3组：≤6个月组（67例），6~12个月组（21例），≥12个月组（8例）；其中Ki67及Ck19在≤6个月组的阳性表达率分别为96%（64/67）、43%（29/67）；在6~12个月组的阳性表达率分别为76%（16/21）、19%（4/21）；在≥12个月组的阳性表达率分别为88%（7/8）、13%（1/8）；Ki67及Ck19的表达在HCC复发时间不同分组间差异有统计学意义（均P<0.05）（表1）。ADC值与肿瘤复发时间不同分组之间呈正相关（r=0.221，P=0.047）。Ki67、Ck19与肿瘤复发时间不同分组之间均呈正相关（r=0.244、0.252，均P<0.05）。按照Ki67、Ck19不同表达进行分组，Ki67+、Ck19+为一组，其余表达（Ki67+、Ck19-；Ki67-、Ck19+；Ki67-、Ck19-）为一组，分析其与肿瘤复发分组之间的相关性，结果显示两者呈正相关（r=0.326，P =0.001）。
96例肝细胞癌不同复发时间段Ki67及Ck19的表达
96例肝细胞癌不同复发时间段Ki67及Ck19的表达
| 复发时间 | 例数 | ki67 | Ck19 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| + | - | + | - | ||
| ≤6个月 | 67 | 64 | 3 | 29 | 38 |
| 6~12个月 | 21 | 16 | 5 | 4 | 17 |
| ≥12个月 | 8 | 7 | 1 | 1 | 7 |
| χ2值 | 7.133 | 6.110 | |||
| P值 | 0.028 | 0.047 | |||
注：Ki67为细胞增殖核抗原；Ck19为细胞角蛋白19
Ki67是一种敏感的特异度增殖细胞标记物，不易被生长因子诱导，能够较好地判断肿瘤的生长增殖特性［8］，可用于鉴别正常分裂细胞和癌细胞，是反映癌细胞增殖活性和生物学行为的重要参数［9］。Ck19是上皮细胞及上皮来源肿瘤细胞骨架系统中间丝的组成成分，属于胆管细胞型细胞角蛋白，可在HCC细胞和间质中假胆管可阳性着色。在本研究中，Ki67及Ck19表达阳性、阴性组间肿瘤脉管癌栓、AFP、术后肿瘤复发、淋巴结转移差异有统计学意义（均P<0.05），并且随着HCC肿瘤分化程度的降低，Ki67的阳性表达率（62%、96%、98%）随之增加（P<0.05），这与Lee等［10］等学者的研究结果一致。这些指标都与HCC患者的复发及预后有相关性，初步提示Ki67及Ck19表达阳性率越高，肿瘤分化程度越低、预后越差，该结论与一些学者的研究结果一致［11, 12］。进一步分析，92%（88/96）复发患者在术后12个月内复发，尤其是在术后6个月以内（77%，67/88）；12个月以上复发患者仅8例（8.3%，8/96）；且6个月以内复发患者Ki67及Ck19阳性表达率（95%、43%）明显高于6个月以上复发患者（Ki67阳性表达率为76%，87%；Ck19阳性表达率为19%，12%），差异均有统计学意义（均P<0.05），表明术后6个月以内HCC复发率最高（Ki67及Ck19的阳性表达率也最高）。随着术后时间的延长，HCC癌肿的复发率明显降低（Ki67及Ck19的阳性表达率也随之减低），推测Ki67及Ck19可以作为评估HCC患者预后、复发的相关因子。进一步分析显示，联合Ki67、Ck19组与肿瘤复发时间的相关系数（0.326）略大于单独分析Ki67、Ck19的相关系数（0.244、0.252），初步认为联合Ki67及Ck19要略优于单独分析Ki67及Ck19。
ADC值可以对肿瘤组织内自由水分子的扩散能力情况进行定量评估，被广泛用于各种实体肿瘤的研究中。目前对于Ki67、Ck19与ADC值的相关性研究还存在争议，有学者［13］在研究乳腺癌时认为Ki67与ADC值无相关性。本研究中，Ck19与ADC值无相关性，而Ki67的表达与ADC值呈负相关（r=-0.214，P<0.05），这与Surov等［14］学者的研究结论一致。进一步分析发现，ADC值与肿瘤复发时间不同分组之间呈正相关（r=0.221，P=0.047），而低Ki67组患者HCC肿瘤的平均ADC值明显高于高Ki67组（P<0.05），提示恶性肿瘤细胞增殖旺盛。单位面积内肿瘤细胞密度增大，Ki67表达增高，ADC值减低，也间接提示ADC值能够在术前为了解HCC生物学特性提供一定的无创影像学依据。
综上所述，Ki67及Ck19在HCC中的异常表达，对HCC术后预后及复发的评估有积极意义。Ki67的阳性表达与ADC值呈负相关，间接提示ADC值能够在术前对HCC生物学特性提供无创影像学依据。
所有作者均声明不存在利益冲突
