从2003年的传染性非典型肺炎到2020年的新型冠状病毒肺炎，呼吸道传染性疾病在不断威胁人类健康，并成为重大的公共卫生问题。据估计，全球每年约390万人死于急性呼吸道感染，为前5位死因之一^［1］。目前预防急性下呼吸道感染（主要是肺炎）及其不良预后的发生已成为临床医学防治多器官功能衰竭的关键，对于呼吸系统感染的防治也具有极大的必要性^［2］。

目前严重的呼吸道感染通常会首先经验性使用广谱抗生素，一旦得到病原学结果，应该在2~3 d内更换合适的药物^［3］，但实际中临床常规病原检测方法难以快速提供准确的病原学结果。据WHO统计，全球约1/3的呼吸道感染患者死于不合理用药。WHO规定门诊抗生素处方比例不应超过门诊所有处方的30%，而国内这一比例超过35%，尤其是急性呼吸道感染中抗生素使用比例超过70%^{［4, 5, 6］}，住院患者抗菌药物使用量远超WHO规定的标准^［7］。对呼吸道感染病原体的早期识别，有助于指导临床合理用药，有效治疗呼吸道感染，并避免耐药的快速出现。然而引起呼吸道感染的病原复杂多样，为识别工作带来了巨大挑战^［8］。

目前细菌感染性疾病诊断金标准仍是分离培养，但其敏感性低且耗时长，通常需要2~3 d才能确定病原体。基于PCR技术的分子诊断方法在临床也有所应用，但这些方法单次检测病原的种类较少。大部分病原微生物在医院临床实验室条件下难以培养，高达60%的感染性病例致病病原体仍不清楚，不利于临床快速诊断^{［9, 10, 11］}。因此，近20年来陆续出现了多种基于基因测序的病原分子诊断技术。

1. 第一代测序：1977年Sanger双脱氧核糖核酸法和1978年Barnes部分核酸替代酶学法标志着第一代基因转化技术体系的建立^［12］。20世纪末期，第一代测序技术正式应用，在人类基因组测序等重大生物医学研究项目中发挥了关键作用。它具有读长较长（>1 kb）、准确率高等特点。通过联合使用针对病原特异位点的PCR扩增和一代测序，能够对病原体进行准确鉴定，例如基于16S rRNA扩增测序进行细菌分类和鉴定已广泛用于临床分子学检测，并逐渐成为分子学检测的金标准。但由于一代测序往往基于特定位点的PCR扩增，导致其检测通量较低。

2. 第二代测序：二代测序（NGS）具有以下几点优势：（1）高通量测序：能够同时获得上百万条读段（read），结合生物编码技术（barcode）能够同时检测大量样本，实现以较低测序成本获得大量数据，为提高检测通量建立了基础；（2）单次测序运行时间短：目前只需24~48 h即可完成，结合快速的生物信息分析技术，相较于临床常规分离培养方法可以更早得到病原结果；（3）基于宏基因组学测序和分析技术，能够直接针对临床样本进行检测，并在种水平识别病原体，可以更好地指导临床规范用药。然而，二代测序也有相应的局限性：（1）不能对病原体RNA直接检测，需要逆转录、PCR扩增等一系列处理，这个过程中易产生碱基的错配或丢失，一定程度上降低了检测的正确性；（2）必须到测序结束才能分析数据，24 h产出报告仍然不能满足临床面对重症感染时对病原诊断的迫切需求；（3）读长较短，目前应用于临床检测的二代测序仪读长一般为75~250 bp，虽然能够准确鉴定病原体，但难以进一步提供病原体表型特征，如毒力、耐药性等相关功能基因的信息。

3. 第三代测序：三代测序以单分子、长读长为特点，不需要对样本进行扩增，可以直接对样本的DNA、RNA进行测序，从而避免二代测序在文库构建和扩增中可能引入的误差。代表性的平台包括牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）基于纳米孔测序技术的MinION、GridION、PromethIon和美国PacBio公司的Single Molecule Real-time （SMRT）等平台为代表。其中纳米孔测序技术起源于Coulter计数器的发明以及单通道电流的记录技术，Hafner等^［13］在2001年开启了固态纳米孔研究的新时代，经过十几年发展，纳米孔技术日益发展成熟。相较于PacBio平台，ONT公司的MinION平台测序具备了便携、快速、实时产出数据等优点。中国成都齐碳科技公司在2020年9月推出了一款名为QNome-9604的纳米孔基因测序仪，该款测序仪能够实现最长读长150 kb以上，可在8 h内稳定输出500 Mb以上数据，适合用于微生物检测、扩增子测序等应用场景，其使用的可分离式芯片进一步降低了单次测序成本。

三代纳米孔测序在病原检测应用中的优点包括：（1）可以在测序过程中实时获得数据进行分析，显著提高检测速度，有时仅10 min就足以确定病原体^［14］。一般来说1 h就可以检测到单个菌株的所有耐药编码靶基因和质粒^［15］，5~6 h就可以得到完整的病原检测结果^［16］，极大地满足了临床对于快速病原体检测的需求；（2）可以直接对病原RNA进行测序，省去了逆转录、PCR扩增等程序，不仅降低了检测成本，也避免了碱基错配或丢失造成的检测误差；（3）对于病原学培养阴性的标本有很好的应用，可以更好地反映病原核酸在多种微生物感染和污染样品中的相对丰度，能检测到常规检查中遗漏或检测不到的条件致病菌和罕见病原体，可以为二次感染提供前瞻性抗生素选择；（4）纳米孔测序仪体积小（MinION平台体积仅有U盘大小），便携性好，可通过笔记本电脑USB接口实现供电和数据生成读取，并且可以满足各种恶劣条件的测序需求。

由于纳米孔测序的快速、实时分析、便携等优点，很多研究证实便携式的纳米孔测序平台在病原检测和分析上有很大的应用潜能，并在很多方面有了成功的应用范例。Quick 等^［17］基于MinION平台设计了基因组检测系统，在几内亚用于流行病的基因组实时监测，对收集到的142例埃博拉患者样本进行检测，结果显示在收到样本后24 h内就能获得结果，而整个测序过程只需15~60 min，基于基因组序列发现了病毒在2个国家之间发生传播，为疫情的防控做出了很大贡献。在此基础上，Hoenen等^［18］在利比里亚开展埃博拉病毒现场测序的过程中，通过对获得的8份样本进行埃博拉基因组测序，也很快检出了病原体。

Chan等^［19］对43份呼吸道样本进行了基于16S rRNA的病原学测序分析，成功鉴定了大多数微生物（47/54，87.04%）和7种常规检查无法检测出来的病原体，平均测序时间为7 min。虽然结果显示MinION测序平台可能对于常见的非病毒性呼吸道病原的检出率有待提高，但其对于罕见的机会性致病菌的检测有可能推进此类病原体引起感染的病因学诊断，并对前瞻性抗生素选择有提示意义。

李鹏等^［20］使用MinION测序技术对轻重症上呼吸道腺病毒感染的鼻咽拭子进行病原检测，同时使用实时PCR检测验证。结果显示MinION测序在轻、重症患者标本中均准确检测到腺病毒，并且在测序的第14、22分钟检测到了混合样本和单个样本中的7型腺病毒序列。叶富强等^［21］使用MinION测序方法对1份上呼吸道感染的咽拭子样本进行了病原学检测，同时使用荧光PCR方法进行验证。结果显示，MinION测序检测到了人呼吸道腺病毒7型和甲型流感病毒H3N2亚型，与实时荧光PCR检测结果一致。整个检测过程中，MinION测序从取样到初步获得检测结果仅花费了18.5 h，其中测序的时间仅15 h。这些研究结果初步展现了纳米孔测序在病原体快速检测中的应用前景。

林彦峰等^［22］对比了MinION测序、BGI测序平台以及病原体培养在肺泡灌洗液中病原体检测的结果，显示MinION测序可以快速且正确地检测到铜绿假单胞菌特异序列。在这项研究中，病原分离培养花费了约50 h，二代测序平台可将周期缩短至1~2 d，然而MinION测序仅需要约12 h就可以得到病原基因组数据，并且可以对测序数据进行实时分析，很大程度上加速了临床诊疗进度。这表明纳米孔测序在病原体实时高通量检测中具有巨大潜力。

Li 等^［23］的研究中，对1例疑似SARS-CoV-2感染的患者首先进行了体液样本的常规RT-PCR检测，结果为阴性；后对痰标本行mNGS，仅检出1条75 bp的SARS-CoV-2基因组片段（覆盖度0.05%），不足以诊断；又对同一份痰标本进行纳米孔测序，检测到SARS-CoV-2基因组序列（17 262条序列数，平均测序深度876.3），同时SARS-CoV-2抗体检测结果呈阳性。最终通过纳米孔测序与抗体检测结果确诊，并通过纳米孔测序数据分析了病毒变异信息，表明了纳米孔测序在新发突发病原体临床诊断上的价值和突出优势。

目前的MinION平台作为三代测序的代表具有很多优点，但依然存在很多问题：（1）测序准确率尚不如二代测序，错误率为5%~15%^［24］；（2）对于同一物种的多个菌株难以区分，有时无法给出正确的病原体信息。因此，在临床检测中应注意其适用场景以及对其分析结果的合理应用。

Charalampous等^［25］提出了对MinION测序的一系列优化方案，增加了测序结果的正确性和灵敏度，其方案如下：（1）通过皂素消除法消除样本中99.9%的宿主DNA，增加MinION测序对病原体的灵敏度；（2）通过改善细胞裂解来提高灵敏度。研究者使用鸡尾酒酶法，发现样本中的细菌DNA增加了约4倍，而使用珠击法发现增加了21倍。优化后的MinION测序在下呼吸道病原检测中的灵敏度为96.6%，特异度为41.7%，不仅提高了检测的灵敏度，也缩短了测序时间，使测序文库的准备时间缩短至2.5 h。相信在不远的将来，纳米孔测序能够广泛应用于临床病原体检测，为呼吸系统感染病原的快速检测和病原学诊断提供及时有效的依据，改善临床用药的困难，提高呼吸系统感染疾病的诊治成功率。