杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由于Xp21.2区抗肌萎缩蛋白基因突变所致X连锁隐性遗传性疾病，多见于男性，女性携带者临床表型多数正常，少数可出现临床症状。流行病学调查显示，女性DMD发病率为1/100 000~1/45 000^［1］，多遗传自母亲，多为X染色体失活偏倚所致。也有罕见的家族史阴性的女性患者，致病突变来源于表型正常的父亲^{［2, 3］}，并推测为父亲生殖细胞或体细胞嵌合体遗传的可能。本文通过1例女性DMD患者家系遗传学分析，经遗传学研究证实源自父亲嵌合体并且存在X染色体失活偏倚致病的罕见病例，探讨女性DMD患者罕见的遗传致病机制。

1. 研究对象：先证者，女，2016年5月就诊于首都儿科研究所附属儿童医院神经内科门诊，就诊时4岁5月龄，主诉发现大运动落后，双下肢肌力差，肌酶升高2年余。患儿1岁6月龄时可独立行走，独立上阶梯困难。查肌电图提示肌源性损害。血生化肌酸激酶（CK）16 338 U/L，肌酸激酶同工酶（CK-MB）>300 U/L，天冬氨酸转氨酶（AST）353 U/L，丙氨酸转氨酶（ALT）217.7 U/L。临床诊断DMD。先证者足月产，母孕产史无特殊事件，围生期体健，先证者父母非近亲结婚且均表型正常。本研究以该先证者及其父母作为家系遗传学研究对象。本研究通过首都儿科研究所伦理委员会批准（批件号：SHERLL 2016033）。

2. 外周血DNA提取：抽取先证者及其父母外周静脉血2 ml，提取基因组DNA。

3. DMD基因多重连续探针扩增（MLPA）技术检测：DNA样品（50~200 ng），98 ℃加热5 min后冷却到25 ℃，分两管后加入配置好的P034/P035探针（荷兰MRC-Holland公司）和MLPA buffer混合液，混匀，95 ℃孵育1 min，60 ℃杂交 16 h。杂交后将温度降至 54 ℃，加入 Ligase-65 混合物，54 ℃孵育15 min，98 ℃加热5 min。将连接产物加入 SALSA PCR 引物，按照以下 PCR 程序扩增：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 20 min。将 PCR 产物置于3730XL分析仪上进行毛细管电泳，最后使用Coffalyser.Net软件分析。

4. 二代测序：通过提取的全基因组DNA构建基因组文库，然后通过探针杂交捕获与神经肌肉病相关的1 624个基因的外显子及相邻内含子区域（50 bp），并进行富集。富集后的目的基因片段通过二代测序仪HiSeq X Ten（美国因美纳公司）测序。目标区域平均测序深度317.74×，其中测序深度达到30×以上的区域占目标基因覆盖度98.338%。

5. Sanger测序验证：根据二代测序结果，用Sanger测序对先证者及其父母进行变异位点验证。针对DMD基因c.4707C>A变异，应用Primer3 设计引物，上游引物序列为5′-TACCATGACGACATACAAGACC-3′，下游引物序列为3′-TTATCATGGTCCTGAAAAGCA CAG-5′，产物长度567 bp。PCR扩增条件：PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；变性95 ℃，30 s；退火57 ℃，30 s；延伸72 ℃，60 s；进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min，PCR产物经ABI3730XL测序仪进行测序。应用Mutation Surveyor软件将Sanger测序结果与DMD基因组参考序列（NM_004006.3）进行比对分析。

6. X染色体失活检测：检测X非随机失活需在X染色体上找出多态位点，以明确两条X染色体来源。人类雌激素受体基因（AR）1号外显子包含（CAG）n区域具有高度多态性，90%的女性均为杂合，因此采用荧光标记引物扩增AR基因该区域，然后进行片段分析，以有效分辨父母来源。先证者DNA分两管进行实验：一管使用甲基化敏感限制性内切酶（Hha I）进行酶切处理；另一管不经任何处理，并将父母样本同时进行检测，以判断变异来源。

7. 变异致病性分析：根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）于 2015 年发布的《遗传变异分类标准与指南》^［4］进行变异致病性分析。

1. DMD基因MLPA分析：测试结果未发现受检者DMD基因外显子存在大片段缺失/重复。

2. 基因二代测序结果及致病性分析（图1）：经检测发现先证者存在DMD基因c.4707C>A（p.C1569X）杂合突变，转录本NM_004006.3。依据ACMG《遗传变异分类标准与指南》^［4］评估，该变异位点导致编码的氨基酸序列提前终止，HGMD数据库收录多个功能丧失型变异致病的报道（PVS1），该变异未在正常人数据库gnomAD中检出（PM2），该患者的表型高度符合DMD表型（PP4），分析为致病性突变（PVS1+PM2+PP4）。

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图1

杜氏肌营养不良（DMD）先证者及父母DMD基因Sanger测序结果 A：先证者DMD基因存在c.4707C>A（p.C1569X）杂合突变（红色箭头）；B：先证者父亲DMD基因存在c.4707C>A（p.C1569X）突变（红色箭头）；C：先证者母亲未检测到该变异（蓝色箭头所示为先证者及其父亲突变位点）

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图1

杜氏肌营养不良（DMD）先证者及父母DMD基因Sanger测序结果 A：先证者DMD基因存在c.4707C>A（p.C1569X）杂合突变（红色箭头）；B：先证者父亲DMD基因存在c.4707C>A（p.C1569X）突变（红色箭头）；C：先证者母亲未检测到该变异（蓝色箭头所示为先证者及其父亲突变位点）

3. Sanger测序验证：经比对，先证者存在DMD基因c.4707C>A（p.C1569X）杂合突变，先证者母亲未携带该突变。进一步验证，先证者无表型父亲携带该位点突变（图2），经2次正反向引物测序，结果均证实为嵌合体，通过Mutation Surveyor的峰图面积计算突变比例约17.7%。

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图2

杜氏肌营养不良（DMD）先证者X染色体失活检测 A：先证者母亲X染色体（277.6）；B：先证者父亲X染色体（282.8）；C：先证者X染色体未经处理PCR结果（277.4先证者母亲/282.7先证者父亲）；D：先证者X染色体Hha I酶切后PCR结果（277.5先证者母亲/282.8先证者父亲），可见证实存在X染色体失活偏倚，母源性X染色体（峰高7 840）过度失活，父源X染色体（峰高2 630）过度活化，峰值大小代表甲基化比例（即被甲基化X染色体才会有PCR产物，未甲基化X染色体均被甲基化敏感的Hha I酶切断，无法扩增出产物），亲源的X染色体甲基化越高，即失活比例越高

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注：绿色箭头示父亲X染色体长度峰，红色箭头示母亲X染色体长度峰

图2

杜氏肌营养不良（DMD）先证者X染色体失活检测 A：先证者母亲X染色体（277.6）；B：先证者父亲X染色体（282.8）；C：先证者X染色体未经处理PCR结果（277.4先证者母亲/282.7先证者父亲）；D：先证者X染色体Hha I酶切后PCR结果（277.5先证者母亲/282.8先证者父亲），可见证实存在X染色体失活偏倚，母源性X染色体（峰高7 840）过度失活，父源X染色体（峰高2 630）过度活化，峰值大小代表甲基化比例（即被甲基化X染色体才会有PCR产物，未甲基化X染色体均被甲基化敏感的Hha I酶切断，无法扩增出产物），亲源的X染色体甲基化越高，即失活比例越高

4. X染色体失活检测：先证者母源X染色体失活比例约80%，存在X染色体失活偏倚，即约80%的细胞均表达的是父源受损的蛋白（图2）。

DMD作为最常见的X染色体连锁隐性遗传性肌肉病，男性常见，女性携带者多无临床症状或仅有肌痛症状，其中53%女性携带者肌酸激酶轻度升高，升高水平平均约306 U/L^［1］。1987年及1986年^{［5, 6］}，分别有学者报道同卵双胞胎女性携带者其一早期发病，并发现发病者存在X染色体失活偏倚。2018年Ishizaki等^［7］总结女性DMD患者93例，其中51例存在X染色体失活偏倚，占54.8%。证实女性携带者若早发病或病情严重，X染色体失活偏倚是常见的致病机制。

X染色体失活是胚胎发育早期发生的剂量补偿机制，以避免男女X染色体基因表达的差异，即女性个体的半数细胞表达父源X染色体上的等位基因，另半数细胞表达母源。理论上，这种嵌合比例为50/50。研究发现，少数女性出现X染色体失活偏倚，并非呈50/50的嵌合比例，其中8%~10%偏离超过80/20^{［8, 9］}，过多表达携带突变基因的X染色体是X连锁隐性遗传病如DMD等的女性携带者致病的主要遗传性机制。男性仅有1条X染色体，故家族史阴性的女性DMD患者，多为父源性X染色体失活偏倚导致致病，而本文先证者已证实存在X染色体失活偏倚。但经非随机失活检测证实母源性X染色体失活比例达80%，致病性突变来源于表型阴性的父亲，故本例先证者为非单一遗传机制所致病的DMD女性患者。

X连锁隐性遗传病鲜有父源遗传的报道，既往X染色体失活偏倚女性致病多为父源性X染色体过度失活机制。Zatz等^［10］曾报道4例父源遗传的DMD女性携带者致病家系。1994年，Pegoraro等^［11］报道10例女性DMD患者，均无家族史，其中父源遗传者8例。X连锁无丙种球蛋白血症家系中也有类似研究结果^［12］。这种由无症状的父亲将致病突变位点传递至其女性子代的现象，多数学者推测来源于父亲生殖细胞或体细胞嵌合。本文DMD家系最终通过Sanger测序反复验证，证实表型阴性的父亲为低比例嵌合状态。Zhou等^［13］对196 219名健康男性DNA进行X染色体分析，存在X染色体嵌合者12名，仅占0.006%，嵌合比例<20%。与本例先证者父亲相似，均无阳性临床表现。而大样本家系分析显示，这种罕见的遗传方式，DMD病例占比不足1%^［14］。

DMD女性患者X染色体失活偏倚已得到广泛认可，而生殖细胞嵌合体遗传家系国内既往已有报道，均来源于患者母亲^{［15, 16］}，本例先证者经基因检测证实其致病基因源自低比例嵌合体携带的父亲，且同时存在母源性X染色体失活偏倚，双重因素造成女性患者发病，这一现象极为罕见，由此带来以下提示：（1）对父亲家系进行DMD基因分析，追溯突变来源，结合本文家系中突变位点既往虽无文献报道，但该突变导致编码的氨基酸序列提前终止，为致病性突变，可深入研究分析X连锁遗传性疾病产生机制。同时也可提示受检者父母再次生育或家系中其他携带者生育，为避免再次出现非随机失活情况发生，均需产前进行遗传筛查。（2）先证者父亲在就诊时无表型，证明这种低比例表达的异常Dystropin蛋白并未引起父亲出现临床表现，但仍应对父亲进行长期随访观察其肌肉组织是否存在进行性变性可能，以深入了解嵌合体携带者远期预后。

综上，对于DMD患者遗传学诊断，女性患者X染色体失活分析应作为常规检查手段。且对于可疑新生突变的患者，仍需警惕父源/母源均有可能存在嵌合体突变的可能，再生育前应提前进行产前基因筛查，降低疾病发生风险。尤其是父系遗传家系，需完善父系家系基因筛查，以及时发现其他携带者，并提供更好的遗传咨询。