对1型糖尿病（T1DM）患者含NLR家族CARD域蛋白4（NLRC4）基因外显子及外显子内含子交界区的罕见变异进行鉴定，并探讨其对基因功能的影响。
选取2017年8月到2020年9月中南大学湘雅二医院代谢内分泌科508例T1DM患者作为病例组，男264例，女244例，年龄［M（Q1，Q3）］为27（11，43）岁。同时选取同期体检科527名健康对照者，男290名，女237名，年龄［M（Q1，Q3）］为47（36，60）岁。对T1DM患者和健康对照者的NLRC4基因的外显子区域进行捕获测序，并进行一代测序验证。构建NLRC4基因野生型和突变型质粒，转染293T细胞，采用免疫印迹试验（WB）检测NLRC4蛋白表达量以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前体（procaspase-1）切割产物含量。在转染野生型或突变型NLRC4质粒的293T细胞中加入放线菌酮（CHX），检测NLRC4蛋白降解情况。使用免疫荧光检测NLRC4蛋白质的定位。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清白细胞介素（IL）-1β浓度。
测序结果显示，4例患者及2名健康对照者NLRC4基因的3号外显子存在杂合变异c.208C>T；2例患者4号外显子存在杂合变异c.1564T>C，1例患者4号外显子存在c.1219G>C；这3种变异可能为T1DM的致病性变异。NLRC4野生型和c.208>T、c.1564T>C、c.1219G>C突变型质粒转染的293T细胞中，NLRC4蛋白表达水平、降解速率、定位以及procaspase-1的切割产物含量无明显改变；但转染c.1219G>C、c.208C>T突变型质粒的293T细胞分泌的IL-1β浓度［M（Q1，Q3）］分别为15.25（12.98，17.52）、15.44（13.81，17.07）ng/L，均低于野生型质粒的18.70（16.59，20.81）ng/L（P=0.020、0.010）。
NLRC4基因外显子罕见变异c.208C>T、c.1564T>C和c.1219G>C可能不改变蛋白质的表达水平、蛋白质的降解及定位，但c.208C>T和c.1219G>C错义突变可能抑制了炎症因子IL-1β的产生，从而对基因功能产生影响。
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1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种自身免疫性疾病，发病机制主要是免疫细胞攻击胰岛细胞，导致胰岛细胞的破坏。T1DM目前被认为是一种复杂性疾病，环境因素和遗传因素都参与了T1DM的发生和发展［1, 2, 3, 4］。T1DM全球的发病率和患病率每年以2%~3%的速度增长［5, 6］。尽管T1DM的病因仍不清楚，但遗传因素在T1DM的发展中起着非常重要的作用。人类全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）发现，除了对T1DM贡献最大的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）区域之外，还有60多个非HLA区域的基因也对T1DM的发生和发展起到一定作用［7, 8］。
最近的研究表明，炎症小体相关基因在自身免疫性疾病、自身炎症性疾病和代谢性疾病中发挥着不可或缺的作用［9, 10, 11, 12, 13, 14］。在巴西东北部的人群中，含NLR家族PYRIN域蛋白3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）基因中的两个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与T1DM相关［15］。而在中国汉族人群中，NLRP1基因与T1DM易感性相关［16］。本课题组前期已证实两个NLR家族CARD域蛋白4（NLR family CARD domain protein 4，NLRC4）炎症小体基因多态性与T1DM患者的谷氨酸脱羧酶抗体（Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibody，GADA）滴度、2 h餐后C肽相关［17］，这提示NLRC4基因可能在T1DM发病过程中发挥了重要作用，但是否存在因果关系需要进一步阐明。本研究旨在鉴定并探讨NLRC4基因变异是否对基因的功能产生影响，为进一步探究其是否参与了T1DM的发病机制奠定基础。
本研究为病例-对照研究，获得中南大学湘雅二医院伦理委员会的批准［（2017）伦审（科）第（045）号］。受试者在入组前均阅读并签署了知情同意书。
1.病例组：选取2017年8月到2020年9月中南大学湘雅二医院代谢内分泌科508例T1DM患者，男264例，女244例，年龄［M（Q1，Q3）］为27（11，43）岁。纳入标准：（1）符合1999年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）糖尿病诊断标准；（2）急性发作，无明显原因引起的糖尿病酮症或糖尿病酮症酸中毒；（3）在疾病诊断后6个月内依靠胰岛素治疗；（4）血清中至少1种胰岛自身抗体［GADA、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体（Protein Tyrosine Phosphatase Autoantibody，IA-2A）、锌转运体8自身抗体（Zinc Transporter 8 Autoantibody，ZnT8A）］为阳性［18, 19］。排除标准：（1）继发性糖尿病；（2）特殊类型糖尿病［例如青少年发病的成人型糖尿病（maturity-onset diabetes of the young，MODY）、线粒体DNA突变相关糖尿病等］或者妊娠糖尿病；（3）合并其他类型的自身免疫性疾病；（4）合并恶性肿瘤。
2.对照组：选取同期体检中心527名健康对照者，男290名，女237名，年龄［M（Q1，Q3）］为47（36，60）岁。纳入标准：75 g口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）中，空腹血糖<5.6 mmol/L和餐后2 h血糖（postprandial 2-h plasma glucose，PPG）<7.8 mmol/L；排除标准：患有心脏、脑、肝、肾或其他慢性疾病，或合并其他类型的自身免疫性疾病。
1.实验材料与试剂：293T细胞由本实验室提供，培养细胞所用到的真核细胞培养基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）由美国Gibco公司提供，ELISA试剂盒由中国江莱生物公司提供，抗HA抗体（兔源性）由美国CST公司提供，抗GAPDH单克隆抗体（兔源性）由美国SIGMA公司提供。
2.NLRC4基因外显子捕获测序及验证：委托上海天昊公司采用FastTarget技术对508例T1DM患者和527名健康对照者的NLRC4基因进行外显子捕获测序。主要包括：样品DNA质量检测、外显子组文库的构建与质检、样品上机测序。
3.NLRC4基因外显子变异验证：使用Sanger测序方法对检测到的变异进行验证，测序引物使用Primer3 v0.4.0在线软件（http：//primer3.ut.ee/）设计，使用PCR技术扩增外显子测序中检测到变异的标本，扩增产物送湖南擎科有限公司进行测序，测序结果与外显子测序结果进行比对分析。
4.NLRC4基因野生型、突变型以及半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1，CASP1）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β质粒的构建：采用pDest-C-HA载体构建NLRC4野生型及突变型质粒，突变型NLRC4通过对NLRC4野生型质粒进行点突变而获得。IL-1β采用pcDNA3.1（+）载体，CASP1采用p3xFLAG-CMV-10载体，ASC采用pEGFP-N1载体。设计引物：利用PCR实验技术获取克隆目标序列。用各个载体相应的酶切位点对应的限制性内切酶处理质粒，进行胶回收和连接反应。挑取平板中的单克隆菌落进行PCR，选择阳性菌落，放置摇菌管中37 ℃摇菌箱过夜。使用过夜菌液提取质粒，选取阳性菌液测序。
5.NLRC4突变及野生型蛋白表达量的测定以及其对炎症小体活化过程的影响：采用Lipofectamine™ 3000试剂盒分别将野生型或突变型质粒以及ASC、CASP1质粒转染293T细胞。转染细胞48 h后，将细胞从培养箱中取出，吸净培养基，加入蛋白上样缓冲液，将贴壁的细胞刮下，加入预制胶的孔中，120~140 V，电泳40 min。将电泳完成之后的胶取出，250 mA转膜70 min，将目的蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。转膜后的膜放至封闭液中封闭，封闭完成后过夜孵一抗，后洗膜孵二抗，再洗膜，显影。
6.放线菌酮蛋白合成抑制实验：当细胞汇合度达70%时，将野生型和突变型质粒转染293T细胞。转染36 h后，在培养基中加入放线菌酮（cycloheximide，CHX）使其浓度为20 μg/ml，抑制蛋白质的合成。分别于0、1、2、4、8 h收集细胞，提取总蛋白，免疫印迹试验（Western blot，WB）检测NLRC4蛋白降解情况。
7.免疫荧光检测细胞内蛋白质定位：将突变型和野生型载体转染293T细胞，转染36 h后将细胞上清液的培养基用巴氏管吸走。用PBS清洗细胞表面。加入4%的多聚甲醛固定。PBS冲洗3次，加入0.5%、TritonX-100通透。PBS冲洗3次，加入BSA封闭液封闭1 h。后4 ℃孵一抗过夜。第2天取出细胞，吸走一抗，PBS冲洗细胞。加入稀释好的二抗，室温孵育1 h，后用PBS冲洗。加入DAPI染核5 min，后用PBS冲洗，在共聚焦荧光显微镜下观察。
8. NLRC4外显子变异对细胞产生IL-1β浓度的影响：将野生型和突变型质粒以及CASP1、ASC、IL-1β载体转染293T细胞，转染细胞24 h后，使用江莱生物有限公司ELISA试剂盒检测细胞上清IL-1β的浓度。
采用SPSS 20.0统计软件进行数据的分析和处理。偏态分布计量资料采用M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ²检验。双侧检验，检验水准α=0.05。
T1DM组男264例，女244例；健康对照组男290名，女237名；两组性别构成比差异无统计学意义（χ²=0.97，P=0.324）。T1DM组的年龄和体质指数均低于健康对照组（均P<0.001）；T1DM组的空腹血糖和餐后血糖均高于健康对照组（均P<0.001），结果见表1。
1型糖尿病患者和健康对照者一般临床资料比较［M（Q1，Q3）］
1型糖尿病患者和健康对照者一般临床资料比较［M（Q1，Q3）］
| 项目 | 1型糖尿病组（n=508） | 健康对照组（n=527） | Z值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | 27（11，43） | 48（36，60） | -19.27 | <0.001 |
| BMI（kg/m2） | 19.31（15.68，22.94） | 20.91（17.24，24.28） | -11.42 | <0.001 |
| 病程（月） | 3.00（0.50，17.00 | - | ||
| FPG（mmol/L） | 9.73（5.32，14.14） | 5.21（4.88，5.54） | -20.39 | <0.001 |
| PPG（mmol/L） | 16.13（9.71，22.55） | 4.98（4.10，5.86） | -27.65 | <0.001 |
| FCP（pmol/L） | 135.46（22.57，248.35） | - | ||
| PCP（pmol/L） | 298.17（40.18，555.16） | - | ||
| HbA1c（%） | 10.31（7.03，13.59） | - |
注：BMI为体质指数；FPG为空腹血糖；PPG为餐后2 h血糖；FCP为空腹C肽；PCP为餐后C肽；HbA1c为糖化血红蛋白；“-”示不存在该数据
检测到17个位于NLRC4基因外显子或剪切部位的罕见变异。对这些SNV/InDel位点进行优先级分类，按照可信度从高到低划分为1级、2级、3级、4级。根据以下几种情况优先选择位点：（1）在患者中出现次数较多的突变；（2）可信度级别为1级的位点；（3）频率较低或者是没有rs号的位点，频率信息参考1000Genomes、1000genome_eas、ESP6500、ExAC03、GeneskyExonDB_Freq等数据库；（4）SNP调用质量高的位点；（5）选择SIFT（Sorting Intolerant From Tolerant）生物信息软件、PolyPhen V2 Score Pred生物信息软件评分为D的位点，SIFT官方注释：D=DAMAGING（致病）；PolyPhen官方注释：D=probably damaging（可能致病）。4例患者及2名健康对照者NLRC4基因的3号外显子存在杂合变异c.208C>T；1例患者4号外显子存在杂合变异c.1564T>C、2例患者4号外显子存在c.1219G>C；这3种变异可能为T1DM的致病性变异。综合以上选择标准，最终选择c.1564T>C、c.1219G>C、c.208C>T变异进行后续研究。
对选择进行后续功能研究的变异进行Sanger测序验证，与参考序列及健康对照者序列对比，证实确实存在该变异（图1）。
为了确定NLRC4基因的错义突变是否导致NLRC4蛋白表达量的改变和影响炎症小体的活化过程，本研究将编码野生型或突变型NLRC4的载体与编码人ASC和CASP1的载体共转染到293T细胞中，并转染GFP荧光质粒判断转染效率，测定3个突变是否影响了NLRC4蛋白质的表达以及procaspase-1切割产物的p10/p20的表达。使用普通荧光显微镜观察EGFP绿色荧光，野生型、突变型质粒转染效率为70%~90%（图2）。提取细胞蛋白裂解物进行WB实验。WB结果显示，3个错义突变c.208>T、c.1564T>C、c.1219G>C不影响NLRC4的表达，表达野生型NLRC4的细胞与表达突变型NLRC4的细胞均未检测到procaspase-1的裂解产物（图3）。
注：NLRC4为含NLR家族CARD域蛋白4；Procaspase-1为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前体；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；1为野生型重组载体；2为c.1564T>C突变型重组载体；3为c.1219G>C突变型重组载体；4为c.208C>T突变型重组载体；5为空载体；6为未转染任何NLRC4载体的293T细胞
CHX是一种能阻止细胞合成蛋白质的化合物，它通过干扰真核细胞翻译过程中mRNA的异位步骤而影响蛋白质的合成。目前其经常被应用于抑制蛋白质合成的实验中。在293T 细胞中转染野生型和突变型NLRC4质粒，转染36 h后加入 CHX 处理，使CHX终浓度为20 μg/ml，并于加入CHX后0、1、2、4、8 h收集细胞进行后续的WB实验，转染野生型质粒与转染突变型质粒的细胞相比，NLRC4蛋白质降解的速率并无差别（图4）。
注：1为加入CHX后0 h；2为加入CHX后1 h；3为加入CHX后2 h；4为加入CHX后4 h；5为加入CHX后8 h；NLRC4为含NLR家族CARD域蛋白4；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶
分别转染突变型NLRC4及野生型NLRC4载体至293T细胞中，然后进行免疫荧光制片、共聚焦拍摄。NLRC4蛋白为位于细胞质内的一种模式识别受体，可以识别进入细胞内的病原分子从而引起免疫应答。结果显示，野生型和突变型转染的细胞，其NLRC4蛋白质都均匀分布于细胞胞质内（图5）。
为了探究突变是否影响NLRC4炎症小体产生IL-1β，本研究将NLRC4突变型或野生型质粒以及ASC、CASP1和IL-1β载体共同转染至293T细胞，ASC载体上带有GFP标签，使用荧光显微镜观察EGFP绿色荧光可知野生型、突变型质粒转染效率为70%~90%（图6）。转染24 h后使用ELISA试剂盒测定细胞上清IL-1β含量，c.1219G>C和c.208C>T突变所产生的IL-1β浓度分别为15.25（12.98，17.52）、15.44（13.81，17.07）ng/L，均低于野生型的18.70（16.59，20.81）ng/L（Z=2.73、3.00，P=0.020、0.010）。
1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，主要特征是胰岛β细胞被免疫细胞破坏而导致胰岛素的绝对缺乏［20］。研究发现适应性免疫和天然免疫都参与了T1DM的发生发展，而炎症小体相关基因已被证实在天然免疫调节中起到重要作用。研究表明炎症小体相关基因多态性与多种自身免疫性疾病有关［21, 22, 23, 24, 25, 26］，而目前对于NLRC4炎症小体的功能研究还较少。
NLRC4属于NOD样受体家族，当病原菌的鞭毛蛋白侵入体内时，NLRC4通过与传感器蛋白NLR家族的凋亡抑制蛋白（NAIP）接触而激活［27］。与NLRC4基因突变相关的疾病包括自身炎症与小儿小肠结肠炎和家族性感冒炎症［28, 29］。本课题组前期研究发现，NLRC4基因的两个多态性rs212704和rs385076与T1DM患者的临床特征相关，提示NLRC4基因可能参与T1DM的发病。故本研究旨在探讨NLRC4基因变异是否影响了基因的功能，从而参与T1DM的发病。
基因突变主要分为内含子突变、外显子突变、UTR区域的突变以及剪切位点的突变等，发生在外显子区域的突变最可能导致生物性状的改变，这可能是由于蛋白质的序列及结构发生变化而造成的。由于前期发现的两个SNP均位于非外显子区域，研究其对基因功能的影响较为困难，本研究纳入了508例T1DM患者和527名健康对照者，对NLRC4基因外显子区域进行捕获测序，选取在患者中频率较高的变异，其作为致病性变异的可能性更大，与T1DM的相关性也更高，从而使研究更有意义。
为了研究这些NLRC4外显子变异是否影响NLRC4炎症小体活化的过程，本研究对NLRC4蛋白质的表达量以及procaspase-1切割产物p10/p20的含量进行检测，结果显示，这些变异并未增加procaspase-1的切割。然而在Canna等［28］和Kitamura等［30］的研究中，NLRC4突变会增加procaspace-1切割产物的含量，这可能是因为不同的变异所处的功能区域不同，对炎症小体活化过程的影响也不同。本研究接着探究变异是否对蛋白质的降解速率及蛋白质的定位产生影响，结果提示，变异对NLRC4蛋白降解速率及蛋白质定位没有显著影响。
当细菌感染人体后，被激活的NLRC4炎症小体发生多聚化，对procaspase-1酶进行切割，产生成熟的caspase-1，进而对多种细胞炎症因子的前体进行切割，使细胞释放成熟的IL-1β等炎症因子。本研究对变异是否影响了炎症小体活化过程进行了研究，结果显示，c.1219G>C和c.208C>T与野生型NLRC4转染的293T细胞相比，细胞上清的IL-1β浓度减少，提示这两个变异对NLRC4炎症小体活化后的信号通路可能有抑制性的作用。突变可能通过抑制NLRC4炎症小体活化过程中对细胞炎症因子前体的切割从而使细胞上清IL-1β浓度减少，并且这两个外显子变异在SIFT生物信息分析软件中的评分为“D”，提示这两个错义突变极有可能对蛋白质的功能产生影响，从而影响NLRC4炎症小体释放炎症因子的过程。
综上，本研究结果表明，位于外显子区域的变异对于炎症小体活化后产生的细胞炎症因子IL-1β浓度有一定影响，提示这些变异可能影响了NLRC4炎症小体产生炎症的过程。但本研究对变异的功能研究仅停留在细胞层面，仅使用293T细胞作为细胞模型，后续还需使用胰岛β细胞和淋巴细胞进行实验，并在动物模型上进一步验证变异的功能。为了更全面地研究NLRC4基因的功能，还可以在细胞中敲除该基因，观察相关指标如细胞炎症因子浓度的变化。
所有作者均声明不存在利益冲突
