探讨及评价快速免疫学检测指标脱颗粒功能测定（CD107a）及穿孔素（Perforin）表达检测在判定原发性噬血细胞综合征［即原发性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（pHLH）］诊断中的效能。
回顾性分析2015年4月至2020年6月由首都医科大学附属北京友谊医院、北京京都儿童医院以及首都医科大学附属北京儿童医院三家医疗机构收治的295例行基因筛查的HLH确诊患者的病例资料，对比快速免疫学功能指标CD107a和Perforin表达与基因筛查的契合度，评价两项指标检测的灵敏度、特异度及阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV），并建立免疫功能学指标对判定pHLH的受试者工作特征（ROC）曲线，选取具有临床指导意义的cut-off值。
295例HLH患者中，男156例、女139例，年龄2个月~70岁，中位年龄18岁。CD107a检测在判定脱颗粒基因缺陷相关pHLH方面，ROC曲线下面积（AUC）为0.920（P<0.001），约登指数最大时对应的灵敏度为83.3%，特异度为89.2%，PPV为33.3%，NPV为98.8%，cut-off值为7.15%。CD107a>10%在判断不涉及脱颗粒相关基因和基因筛查阴性的患者方面，准确度为81.6%。Perforin表达测定在判定家族性噬血细胞综合征2型（FHL2）方面，在基于实验室正常检测值（≥81%）情况下，该项检测的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为88.2%、64.2%、20.3%和98.1%。建立ROC曲线进一步优化cut-off 值，计算AUC为0.933（P<0.001），约登指数最大值对应的cut-off值为62.34%，此时灵敏度仍保持在88.2%，特异度、PPV和NPV分别提升为91.5%，51.7%和98.7%。
CD107a和Perforin测定对涉及细胞毒功能受损的pHLH具有较好的早期预判意义，选取适当的cut-off值，可为临床精准诊断提供依据。
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噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（hemophagocytic lymphohistocytosis，HLH）又称噬血细胞综合征，是由各种病因引起的巨噬细胞和淋巴细胞过度活化的一种危及生命的炎症反应综合征。由于触发因素不同，通常被分为“原发性/遗传性”和“继发性/获得性”两大类。原发性HLH（primary HLH，pHLH）的主要发病基础是由基因缺陷引起的淋巴细胞毒功能受损或炎性相关过度免疫激活［1, 2］。国际组织细胞协会关于pHLH确诊指南［3］推荐是遗传分子学筛查发现明确的基因缺陷。快速免疫学功能检测主要包括CD107a、自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性以及基因缺陷蛋白表达鉴定技术等，由于具有较优的时效性目前已被提倡用于pHLH的早期快速预判［2，4, 5, 6, 7］。本研究通过对295例HLH患者的基因筛查结果与CD107a、Perforin表达结果进行分析，评价快速免疫学指标对判定pHLH的诊断效能。
回顾性分析2015年4月至2020年6月期间由首都医科大学附属北京友谊医院、北京京都儿童医院以及首都医科大学附属北京儿童医院三家医疗机构收治的295例完成基因筛查的HLH确诊患者（符合国际组织细胞协会推荐的HLH-2004诊断标准）的临床资料，分析快速免疫学指标CD107a及Perforin表达检测与基因筛查结果的契合度（如患者多次进行指标测定，选取首次有效结果），并对免疫学指标对pHLH的诊断效能［灵敏度、特异度及阳性预测值（positive predictive value，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）］进行评价。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则及相关伦理要求。
295例患者行基因筛查的方法包括目标区域捕获测序（Gene panel）、全外显子测序和Sanger测序，都至少包含了PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、LYST、RAB27A、ADTB3A、SH2D1A、BIRC4、ITK、CD27和MAGT1共12个基因，并以上述12个pHLH相关已知基因作为分析目标，对测序结果进行筛选判定。序列变异的解释基于人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD），变异致病性分类依据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）推荐的标准和指南［8］进行。本研究所选取的突变阳性位点是致病性分析判定为致病（pathogenic）、可能致病（likely pathogenic）以及部分致病性尚未明确（variants of uncertain significance，VUS）的非同义突变。
1. CD107a表达测定：分离提取患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）并按照特定比例加入K562靶细胞进行刺激共孵育，同时将未加入靶细胞刺激的设为对照。使用CD3-FITC、CD8-APC、CD56-PC5.5、CD107a-PE抗体（美国eBioscience公司）进行流式细胞术检测（国家发明专利号：ZL201610013454.1）。通过刺激前后NK细胞表面囊泡膜蛋白标志物CD107a阳性细胞的变化幅度（NK-ΔCD107a）来评价NK细胞脱颗粒功能水平，分别设判定参考区间（<5%为功能缺如；5%~10%为功能减低；>10%为功能正常）［9］。
2. Perforin表达测定：分离提取患者PBMCs，使用CD3-FITC、CD8-PerCP、CD56-APC抗体（美国eBioscience公司）标记后进行细胞固定及破膜，采用Anti-Perforin（美国eBioscience公司）标记细胞内蛋白，通过流式细胞术测定NK细胞内Perforin的表达含量。
本研究中三家医疗机构检测采用统一的实验室执行标准。
采用SPSS 25.0统计学软件进行分析，患者年龄不符合正态分布，采用中位数和范围描述。建立受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线用于确定CD107a及Perforin表达检测诊断pHLH的灵敏度和特异度，并选取对应的最佳cut-off 值，计算PPV和 NPV。分别评估了在基于原本实验室正常检测范围下，上述两项快速免疫学指标判定相关基因突变的灵敏度、特异度、PPV和NPV。双侧检验，检验水准α=0.05。
1. 患者基本资料：本研究295例HLH患者中，男156例、女139例，年龄2个月~70岁（其中≤2岁者44例，>2~<18岁者100例，≥18岁者151例），中位年龄18岁。
2. 基因突变情况：295例测序结果基于上述12个已知相关基因进行分析，发现基因突变者124例，基因筛查阴性者171例。在124例基因突变的患者当中，突变类型包括：框架/非框架移码、无义突变、错义突变和剪接位点突变。将突变按照涉及脱颗粒相关基因（UNC13D、STX11、STXBP2、LYST、RAB27A和ADTB3A）的程度进行分组，发现存在双等位基因纯合/复合杂合突变者18例，涉及两个（及以上）脱颗粒相关基因的单等位基因突变者10例，仅涉及1个脱颗粒相关基因的单等位基因突变者58例，不涉及脱颗粒相关基因突变者38例。此外，在124例基因突变患者中，发现存在PRF1双等位基因纯合/复合杂合突变［家族性噬血细胞综合征2型（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 2，FHL2）］及SH2D1A、BIRC4和MAGT1基因半合子突变［X连锁淋巴增生性疾病1型（X-linked lymphoproliferative disease type 1，XLP1）、X连锁淋巴增生性疾病2型（XLP2）和镁离子转运相关免疫缺陷（X-linked immunodeficiency with magnesium defect，Epstein-Barr virus infection，and neoplasia，XMEN）］者共26例，其中同时存在脱颗粒相关基因突变者5例，余21例不涉及脱颗粒相关基因突变。
3. CD107a检测的诊断效能：本研究295例患者均完成了CD107a检测，在双等位基因纯合/复合杂合突变的患者（脱颗粒基因缺陷相关pHLH，n=18）当中，CD107a<5%者10例（10/18，55.6%），5%~10%者7例（7/17，41.2%），>10%者仅1例（1/17，5.9%）；在涉及两个（及以上）脱颗粒相关基因的单等位基因突变的患者（n=10）中，CD107a<5%者3例（3/10，30.0%），5%~10%者4例（4/10，40.0%），>10%者3例（3/10，30.0%）；在涉及一个脱颗粒相关基因的单等位基因突变的患者（n=58）中，CD107a<5%者3例（3/58，5.2%），5%~10%者21例（21/58，36.2%），>10%者34例（34/58，58.6%）；在不涉及脱颗粒相关基因突变的患者（n=38）中，CD107a<5%者1例（1/38，2.6%），5%~10%者4例（4/38，10.5%），>10%者33例（33/38，86.8%）；在基因筛查阴性患者（n=171）中，CD107a<5%者7例（7/171，4.1%），5%~10%者28例（28/171，16.4%），>10%者136例（136/171，79.5%）。此外，在确诊FHL2、XLP及XMEN同时不涉及脱颗粒相关基因突变的患者（n=21）当中，未发现CD107a<5%的结果，5%~10%者3例（3/21，14.3%），>10%者18例（18/21，85.7%）。
将295例患者CD107a检测数据与基因筛查结果进行比对分析，发现在鉴定脱颗粒基因缺陷相关pHLH方面，当选取CD107a<5%作为判定cut-off值时，灵敏度仅为55.6%（10/18），特异度为94.9%（263/277），PPV为41.7%（10/24），NPV为97.0%（263/271）；当选取CD107a≤10%作为cut-off值时，灵敏度为94.4%（17/18），特异度为74.4%（206/277），PPV为19.3%（17/88），NPV为99.5%（206/207）。同时通过建立ROC曲线确立优化的cut-off值，计算ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为0.920（P<0.001），发现约登指数最大值为0.725，此时CD107a对应的cut-off值为7.15%，灵敏度为83.3%（15/18），特异度为89.2%（247/277），PPV和NPV依次为33.3%（15/45）和98.8%（247/250）（表1、图1）。计算CD107a>10%在鉴别不涉及脱颗粒相关基因和基因筛查阴性患者，与所有涉及脱颗粒相关基因患者的效能方面，对应的灵敏度、特异度、PPV及NPV分别为80.9%（169/209），55.8%（48/86），81.6%（169/207）和54.5%（48/88）。
CD107a选取不同cut-off值对脱颗粒相关基因缺陷pHLH的诊断效能
CD107a选取不同cut-off值对脱颗粒相关基因缺陷pHLH的诊断效能
| cut-off值 | 灵敏度 | 特异度 | 约登指数 | PPV | NPV |
|---|---|---|---|---|---|
| 5.00% | 55.6% | 94.9% | 0.506 | 41.7% | 97.0% |
| 7.15% | 83.3% | 89.2% | 0.725 | 33.3% | 98.8% |
| 10.00% | 94.4% | 74.4% | 0.688 | 19.3% | 99.5% |
注：pHLH为原发性噬血细胞综合征；PPV为阳性预测值；NPV为阴性预测值
注：AUC为曲线下面积；PHLH为原发性噬血细胞综合征；虚线为参考线
4. Perforin表达测定的诊断效能：295例患者中182例完成了Perforin表达测定，其中存在PRF1双等位基因纯合/复合杂合突变（FHL2）患者17例（10例存在大片段缺失或移码突变，7例为双等位基因错义突变），Perforin表达减低者15例（15/17，88.2%）；PRF1单等位基因突变携带者7例，Perforin表达减低者2例（2/7，28.6%）；PRF1基因突变阴性者158例，Perforin表达减低者57例（57/158，36.1%）。将Perforin表达测定与基因筛查结果进行对照，发现在基于实验室正常检测值（≥81%）情况下，判定FHL2的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为88.2%（15/17），64.2%（106/165），20.3%（15/74）和98.1%（106/108）。建立ROC曲线进一步优化cut-off值，计算AUC为0.933（P<0.001），约登指数最大值为0.798，发现对应的最佳cut-off值为62.34%，此时灵敏度仍为88.2%（15/17），特异度、PPV和NPV分别提升为91.5%（151/165），51.7%（15/29）和98.7%（151/153）（图2）。
注：AUC为曲线下面积；FHLZ为家族性噬血细胞综合征2型；虚线为参考线
关于pHLH诊断，国际组织细胞协会在HLH-2004诊断指南［3］中明确指出，基因筛查是确诊金标准。由于HLH病情进展迅猛，快速免疫学指标检测可在短短2 d之内，在基因筛查结果报告之前对pHLH作出迅速预判并对后续治疗策略的选择具有提示意义，因此国际上关于HLH的诊断流程推荐将其作为快速筛查pHLH的有效手段。
CD107a即溶酶体相关膜蛋白-l（lysosomal-associated membrane protein-1，LAMP-1），是囊泡膜蛋白的主要成分，当NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）发挥细胞毒功能时，溶细胞颗粒被转运出胞，同时CD107a被转运至细胞膜表面并可被检测到，此过程涉及调控囊泡转运的多基因共同参与［10, 11］。因此，通过流式细胞术检测细胞毒细胞脱颗粒水平可快速鉴定存在颗粒胞吐功能缺陷的pHLH［家族性噬血细胞综合征3~5型（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis types 3-5，FHL3-5）、Griscelli 综合征2（Griscelli syndrome type 2，GS-2）、Chediak-Higashi 综合征（Chediak-Higashi syndrome，CHS）和Hermansky-Pudlak 综合征2（Hermansky-Pudlak syndrome type 2，HPS-2）］，并与其他遗传性缺陷如FHL2、XLP、XMEN等以及继发性HLH相区分。目前国际推荐根据NK细胞上ΔCD107a表达高低进行区间设定：<5%为功能缺如，5%~10%为功能减低，>10%为功能正常［9］。在实际应用当中，临床医师通常关注的是选取怎样的cut-off值对诊断/排除pHLH更具有临床指导意义。本研究发现，将CD107a<5%作为判定脱颗粒基因缺陷相关pHLH的cut-off值时，虽然PPV可达41.7%，特异度和NPV分别为94.9%、97.0%，但灵敏度仅为55.6%，这意味着近一半的脱颗粒基因缺陷相关pHLH可能被漏诊；当将CD107a的cut-off值提高至≤10%时，灵敏度升高至94.4%，特异度和NPV分别为74.4%、99.5%，而PPV降至19.3%，意味着在该cut-off值下筛检判定脱颗粒基因缺陷相关pHLH的准确度仅不足1/5，因此更多初筛阳性的患者会被纳入疑似对象需要进一步行基因筛查验证。鉴于CD107a表达测定应首先作为一个良好的筛选测试并保证其在临床实践中具有相对较好的阳性判定指导意义，本研究建立ROC曲线进一步筛选优化cut-off值，发现约登指数最大时对应的cut-off值为7.15%，其灵敏度、特异度和NPV分别为83.3%、89.2%和98.8%，此时PPV为33.3%，提示判定存在脱颗粒基因缺陷相关pHLH的预测概率为1/3。此外，本研究还发现，CD107a>10%具有较好的排他性意义，即在判定不涉及脱颗粒相关基因和基因阴性患者方面，PPV为81.6%，提示排除存在脱颗粒相关基因突变的准确度可达80%以上，这也在一定程度上为临床同时排查其他HLH病因提供判定依据。
Perforin表达测定是通过流式细胞术检测蛋白表达量的多少来间接反映是否存在目标基因异常的一种手段［6，12］。本研究发现在基于实验室正常检测值（≥81%）情况下，判定FHL2的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为88.2%，64.2%，20.3%和98.1%。由于PRF1基因不同突变类型Perforin表达减低程度不同，建立ROC曲线进一步优化cut-off 值，发现对应的最佳cut-off值为62.34%，此时灵敏度仍保持在88.2%，特异度由64.2%提升为91.5%，PPV由20.3%提升为51.7%，NPV为98.7%，提示优化cut-off值后Perforin表达测定在判定FHL2的假阳性结果大幅减少，且预测准确度>50%，意味着一半以上的临床筛检阳性患者可对FHL2进行正确预判，同时超过98%的检测阴性患者可明确排除诊断。需注意的是，检测所采用的蛋白抗体品牌不同，可能存在目标蛋白特异度结合位点及覆盖度的差异，从而影响判定结果的灵敏度及特异度；再者一些错义突变导致蛋白空间构象的改变也可能合成正常数量的变异蛋白，此时可同时结合NK细胞活性检测［13］作为补充验证。
快速免疫学指标测定对于pHLH的早期诊断及治疗策略的选择具有重要提示意义。受累基因的差异及突变类型的不同导致细胞毒功能受损程度不同，HLH临床表型、发病年龄及复发风险也各异［14］，如：FHL中PRF1基因突变导致细胞毒功能受损最为严重，初发HLH后如未能尽早完成移植，复发概率基本上为100%，其次是UNC13D；免疫缺陷综合征（色素相关HLH）中，RAB27A基因突变导致的细胞毒功能缺陷程度及HLH伴发率远较AP3B1基因突变要高［1］；而在一些原发性免疫缺陷病中HLH仅为罕见并发症［5，15, 16］。此外，双等位基因的大片段受损或缺失较复合杂合错义突变严重，其次是双/多基因单等位基因突变。因此，目前国际上较为推荐根据不同类型pHLH的复发风险（概率从100%到罕见）来评估患者需要进行异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）的迫切程度。而CD107a和Perforin测定临床应用的关键意义在于可对涉及细胞毒功能严重受损的高复发风险的pHLH进行早期迅速预判，并提早为allo-HSCT做准备。本研究数据表明，在考虑灵敏度、特异度的同时，选取适当的cut-off值对提高诊断准确度具有重要意义，为临床提供更为精准的诊治指导。
虽然目前基因筛查对于诊断pHLH仍是金标准，但免疫功能学指标可更高效直观反映细胞功能状态，尤其对于一些基因筛查被判定为致病性未明的位点具有很好的补充提示作用［6］。本研究数据结论是基于本研究样本群体得出的，今后可进一步扩大样本量进行评估。另外，随着全外显子测序及全基因组测序技术的深入开展，pHLH相关候选基因在不断扩展，更多细胞功能学测定技术及补充试验尚有待进一步探索开发。当多项免疫学功能指标与临床表型均指向同一方向时，诊断的判定将会更加确认。优化pHLH诊断体系/流程是今后需要持续努力的方向。
所有作者均声明不存在利益冲突
