常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是人类最常见的单基因遗传异质性肾病，发病率为1/1 000~1/400^{［1, 2, 3］}。ADPKD属延迟显性遗传，患者多在40岁后发病，主要表现为逐渐增多、增大的双肾多发性囊肿，约50%患者到60岁左右发展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）^{［4, 5］}，需进行肾透析或肾移植治疗，ADPKD导致的ESRD占总ESRD的10%^{［5, 6］}。ADPKD也是一种系统性疾病，高血压是常见的症状，常伴发肝囊肿、脾囊肿、颅脑动脉瘤、心脏瓣膜异常、夹层动脉瘤、腹壁病等结缔组织缺陷，严重危害人类健康^［6］。ADPKD有时也可合并Caroli病和Caroli综合征^［7］。传统认为ADPKD主要致病基因为PKD1（81%）和PKD2（10%~22%）^［8］，前者患者临床症状往往更加严重，且更早发展为ESRD^［9］。国外近期发现的GANAB基因被认为是ADPKD第3种致病基因^{［10, 11］}。PKD1基因的突变位点较多，且不断有新的致病基因突变被发现和证实，给ADPKD的诊断和遗传咨询带来了困难。本研究对1个ADPKD家系进行高通量测序（next generation sequencing，NGS），旨在找到患者的致病突变基因，明确家系的发病原因。

1. 先证者临床表型：先证者入院血压：170/103 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；24 h动态血压结果提示：（1）24 h血压平均值：139/86 mmHg；（2）白天血压均值：141/85 mmHg；（3）夜间血压平均值：135/87 mmHg；（4）夜间血压下降率：2.4%~4.3%，24 h血压呈非勺型。尿常规检测潜血阳性，血肌酐升高。B超示：双肾体积增大并异常回声，考虑成人型多囊肾并多发结石；肝囊肿。主要表现为：双肾体积增大，大小分别约130 mm×76 mm（左）、144 mm×72 mm（右）；肾内充满众多大小不一的无回声区，较大分别约33 mm×22 mm（左）、48 mm×44 mm（右），囊与囊之间见少量肾实质回声；集合系统受压变形，肾盂、肾盏内见多个点状、斑状或团状强回声，左肾集合系统分离约17 mm，见图2A、B。肝脏实质回声欠均匀，肝内见数个无回声区，较大约15 mm×11 mm，边界清，内透声好，见图2C。中腹部CT示：双侧多囊肾改变伴左肾结石，肝脏多发囊肿。

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图2

常染色体显性多囊肾病先证者B超检查图像 A：多囊肾（左）；B：多囊肾（右）；C：多囊肝

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常染色体显性多囊肾病先证者B超检查图像 A：多囊肾（左）；B：多囊肾（右）；C：多囊肝

2. 基因突变检测结果：NGS结果显示先证者PKD1基因存在c.11017-10C>A杂合突变，Rossetti等^［3］报道这是一个剪接突变，生物信息学分析该突变会减弱38号外显子剪接受体位点上游聚嘧啶区，影响外显子的剪接。Sanger测序验证先证者及其二弟（Ⅱ₄）皆存在c.11017-10C>A杂合剪接突变；此外，还检测出先证者妹妹（Ⅱ₈）、女儿（Ⅲ₁）和侄女（Ⅲ₃）为此突变携带者，见图3。筛查150名健康体检者样本均为野生型，排除其为多态性的可能。

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图3

常染色体显性多囊肾病家系PKD1基因Sanger测序结果 A：野生型；B：突变型，先证者PKD1基因携带c.11017-10C>A杂合剪接突变，箭头所示为突变位点

图3

常染色体显性多囊肾病家系PKD1基因Sanger测序结果 A：野生型；B：突变型，先证者PKD1基因携带c.11017-10C>A杂合剪接突变，箭头所示为突变位点

3. 人群频率和生物信息学分析：该突变在ExAC和1000 genomes数据库未见报道，但已被dbSNP（rs555703777）、ClinVar（RCV000992548.1）、HGMD（CS002149）、PKDB、Mutation Taster和PhyloP数据库收录，目前尚无该位点突变频率报道。ClinVar、HGMD、PKDB和Mutation Taster显示临床意义分别为致病、已知致病、极可能致病和已知致病。PKDB显示突变为剪接突变，可能产生Arg3672fs1X改变；Mutation Taster软件预测显示为剪接突变，可能影响蛋白功能，有害性评分为0.999（越靠近1越有害）；PhyloP预测得分为0.354。

目前研究较多的2个ADPKD致病基因为PKD1（16p13.3）和PKD2（4q22）^［13］。PKD1基因由46个外显子组成，转录后产生14 138 bp（NM_001009944）的mRNA，编码4 303个氨基酸组成的多囊蛋白1（polycystin1，PC1）；PKD2基因编码多囊蛋白2（polycystin2，PC2）。由于ADPKD属延迟显性遗传，因此早期诊断十分重要。ADPKD主要依靠“家族遗传史+临床表现+影像学检查”三联法临床诊断。目前，超声诊断是国内外ADPKD临床常规首选诊断方法^［14］，但是当缺乏家族史或者某些数目少且囊肿局限于肾脏的病例中，难以鉴别ADPKD与单纯或获得性囊肿时，直接基因诊断非常重要。由于PKD1基因具有高度异质性，其5′端1~33号外显子区在16号染色体上有6个高度同源的假基因，给ADPKD的分子诊断带来极大困难^［9］。长片段PCR、高分辨率变性液相色谱、目标区域捕获二代测序等办法可用于解决这个问题。NGS是当前诊断的重要基因检测技术^［15］。

本研究采用NGS结合Sanger测序发现了1个PKD1基因杂合剪接突变导致的ADPKD家系。先证者及Ⅱ₄、Ⅱ₈、Ⅲ₁、Ⅲ₃均携带c.11017-10C>A突变，该突变于1999年由Perrichot等^［16］首次报道，先证者是法国1例43岁就发展为ESED的中年女性患者。2000年Bogdanova等^［17］再次报道并验证该突变在家系中表型-基因型共分离。2007年Rossetti等^［3］和Garcia-Gonzalez等^［18］，2012年Audrézet等^［8］也报道了该突变。截至目前，PKDB数据库己有超过2 000个PKD1基因突变，本研究在中国人群中再次验证了该突变。Rossetti等^［3］采用反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术验证了c.11017-10C>A会对PKD1基因的转录本产生影响，一方面使38号外显子跳跃的转录本表达量增加，另一方面产生了1个新的转录本（该转录本保留了38号内含子）。Rossetti等^［3］还运用变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技术，证实了上述新转录本中发生新的变异（S3673fsX3674），最终造成PC1蛋白翻译提前终止，形成只有3 672个氨基酸的截短蛋白。PC1蛋白由N端细胞外区、跨膜区（包括11次跨膜糖蛋白，行使信号传递作用）和细胞内区（几个潜在磷酸化位点及与PC2蛋白形成复合物的C端螺旋-螺旋结构域）3部分组成^［19］。截短蛋白因其缺失C端6个跨膜区及螺旋-螺旋结构域，推测这可能导致PC1蛋白信号传递及胞内定位异常，且不能与PC2蛋白结合形成复合物，从而失去正常功能，进而影响后续的信号传导异常，引发一系列细胞生物学行为的改变，造成肾上皮细胞异常增生、分泌异常活跃、囊肿增大，最终导致该家系多囊性肾病的发生。

Hu等^［20］对中国人群26个多囊肾病家系进行了基因诊断，检测出24个不同的PKD1基因突变，包括12个截短突变、3个剪接突变、8个错义突变、1个外显子缺失突变。其中有5例截短突变的患者已进入ESRD（41~52岁），且都患有肾性骨病。影响ADPKD预后的主要因素是疾病的基因型：PKD1突变（尤其是PKD1截短突变）的患者较PKD2突变患者进入ESRD更早^［21］，因此，本研究先证者及Ⅱ₄（分别为46、45岁）更要谨防进入ESRD。由于ADPKD属延迟显性遗传，且尚无有效的治疗方法，该病在早期往往无临床症状，因此在ADPKD患者出现病症前及产前分子诊断显得十分重要，在高危人群（患者的直系亲属）尚无临床症状前，可明确是否为ADPKD患者^［22］。除了己知的患者（先证者及Ⅱ₄）外，本研究还发现了家系内3个携带该突变的潜在患者（Ⅱ₈、Ⅲ₁、Ⅲ₃），后期随访中均告知其要及早预防并发症，保护肾功能，提高生活质量。

综上所述，本研究发现了中国患者PKD1基因c.11017-10C>A突变导致的ADPKD，丰富了人类PKD1基因突变谱，为早期发现症状前患者等提供了参考依据。